ARRDC3預測人類前列腺癌進展和預后的相關性研究

鄭煜　林卓遠　陳潮江　李健新

【摘要】目的確定含抑制結構域的蛋白3（ARRDC3）與微小核糖核酸-30d（miR-30d）在前列腺癌中的表達及ARRDC3的高低表達與前列腺癌進展和預后的相關性，探討ARRDC3抑制前列腺癌進展的相關機制。方法采用實時定量PCR和蛋白免疫印跡法檢測轉染后的抑制表達和過表達miR-30d細胞株中ARRDC3 mRNA和蛋白表達情況，分析Taylor數據庫中ARRDC3表達水平與前列腺癌患者的臨床特征和預后的關系，構建ARRDC3抑制表達和過表達的DU145和LNCaP細胞株，分別采用細胞增殖實驗、劃痕實驗、侵襲實驗分析ARRDC3對前列腺癌細胞功能的影響。結果實時定量PCR和蛋白質免疫印跡法分析結果顯示，ARRDC3 mRNA及蛋白表達水平在抑制表達miR-30d的LNCaP細胞株中均上調（P均<0.001），在過表達miR-30d的LNCaP細胞株中均下調（P均<0.001）。Taylor數據庫分析顯示，生化復發、術后淋巴結轉移和高Gleason評分值者的ARRDC3 mRNA表達水平較低（P均<0.05）。Log-rank檢驗顯示，術后無生化復發者ARRDC3 mRNA表達水平高（P<0.05）。細胞增殖實驗結果顯示，LNCaP與DU145細胞中，與無過表達ARRDC3（NC組）比較，過表達ARRDC3（ARRDC3組）的OD450均較低（P均<0.001）；與無抑制ARRDC3表達（KO-NC組）比較，抑制ARRDC3表達（KO-ARRDC3組）的OD450均較高（P均<0.001）。LNCaP與DU145細胞劃痕實驗及侵襲實驗結果均顯示，與NC組比較， ARRDC3組的移行細胞數及穿膜細胞數較少；與KO-NC組比較， KO-ARRDC3組的移行細胞數及穿膜細胞數較多。結論ARRDC3為前列腺癌的抑癌基因，并與前列腺癌淋巴結轉移和術后生化復發有關，可作為前列腺癌進展和預后預測的標志物。

【關鍵詞】ARRDC3；前列腺癌；預后

【Abstract】ObjectiveTo determine the expression levels of ARRDC3 and miR-30d in prostate cancer， analyze the correlation between the expression of ARRDC3 and the progression and prognosis of prostate cancer and investigate the mechanism of the inhibitory effect of ARRDC3 upon the progression of prostate cancer. MethodsThe expression of ARRDC3 at the mRNA and protein levels was measured by real-time quantitative PCR and Western blot in the cell lines with down-regulating and over-expressing miR-30d after transfection. The relationship between ARRDC3 expression in the Taylor database and the clinical characteristics and prognosis of prostate cancer patients was analyzed. The DU145 and LNCaP cell lines with down-regulating and overexpressing ARRDC3 were established. The effect of ARRDC3 upon the function of prostate cancer cells were analyzed by cell proliferation assay， scratch assay and invasion assay. ResultsReal-time quantitative PCR and Western blot demonstrated that the expression levels of ARRDC3 mRNA and protein were significantly up-regulated in the LNCaP cell lines after the expression of miR-30d was down-regulated （both P<0.001）， whereas remarkably down-regulated in the LNCaP cell lines when miR-30d overexpressed （both P<0.001）. Taylor database analysis revealed that the expression level of ARRDC3 mRNA was significantly down-regulated in the patients with biochemical recurrence， postoperative lymph node metastasis and high Gleason score （all P<0.05）. Log-rank test showed that a higher expression level of ARRDC3 occurred in the patients without postoperative biochemical recurrence （P<0.05）. Cell proliferation assay demonstrated that the OD450 of LNCaP and DU145 cells overexpressing ARRDC3 （ARRDC3 group） was significantly lower compared with that of LNCaP and DU145 cells without overexpression of ARRDC3 （NC group） （P<0.001）. Compared with the cells without down-regulation of ARRDC3 expression （KO-NC group）， the OD450 of the cells down-regulating the expression of ARRDC3 （KO-ARRDC3 group） was significantly higher （P<0.001）. Cell scratch and invasion assay indicated that compared with the NC group， the quantity of of migrating and trans-membrane cells was significantly lower in the ARRDC3 group. Compared with the KO-NC group， the quantity of migrating and trans-membrane cells was significantly higher in the KO-ARRDC3 group. ConclusionsARRDC3 is an anti-oncogene of prostate cancer， which is associated with lymph node metastasis and postoperative biochemical recurrence of prostate cancer. ARRDC3 can be considered as a marker for predicting the progression and prognosis of prostate cancer.

【Key words】ARRDC3； Prostate cancer； Prognosis

由于前列腺癌具有發展慢、發病隱匿的特點，早期可無癥狀，目前血清前列腺特異性抗原（PSA）的檢測是篩查前列腺癌最重要的參考指標，但是其對前列腺癌早期診斷的靈敏度和特異度并不理想。最近國內外專家對前列腺癌篩查的標志物研究層出不窮，而且在利用生物標志物篩查前列腺癌術后淋巴結轉移和預測復發方面的研究也取得了突破性進展[1-3]。研究已經證實微小RNA-30d（miR-30d）可促進前列腺癌細胞的增殖、侵襲和遷移[4]。目前有關ARRDC3在腫瘤的報道主要集中在其作為腫瘤抑制基因抑制乳腺癌的進展[5-6]。我們利用基因表達譜芯片技術在LNCaP和DU145細胞株中分析過表達miR-30d的差異表達下調基因，其中含抑制結構域的蛋白3（ARRDC3）表達明顯下調。為此，本研究檢測了ARRDC3與miR-30d在前列腺癌中的表達關系及ARRDC3表達高低與前列腺癌進展和預后的相關性，探討其抑制前列腺癌進展的相關機制。

材料與方法

一、 材料

BLAB/c裸鼠8只（SPF級，體質量15.0～21.5 g），雄性，4～6周齡，購于中山大學實驗動物中心。2種前列腺癌細胞株（DU145/LNCaP）購買于美國種質保藏中心（ATCC）公司。

二、主要試劑和儀器

脂質體Lipofectermine 2000購自美國Invitrogen公司；Trizol試劑購于Invitrogen公司，rTaq DNA聚合酶、逆轉錄試劑盒（Prime ScriptTM RT Reagent Kit）、SYBR Green熒光定量PCR試劑盒均為TAKARA公司產品；用于抑制ARRDC3表達的KO-ARRDC3及其空白對照KO-NC均購置于美國CST公司，ARRDC3抗體（BS-8077R）購于北京博奧森公司。iCycler iQ5熒光定量PCR儀購自美國Bio-Rad公司，Nano Drop ND-1000微量核酸定量儀購自美國Thermo公司；CCK-8細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒購自碧云天生物技術研究所；Woundhealing和Transwell小室購自美國Corning公司。

三、方法

1.ARRDC3 mRNA及蛋白表達水平的檢測

按照RNA提取試劑盒說明書提取抑制表達和過表達miR-30d的LNCaP細胞株中總RNA并進行逆轉錄，根據儀器所提供的實驗方案配置SYBR Green PCR Master Mix 10 μl，上游引物0.5 μl，下游引物0.5 μl，β-actin作為內參，按照PCR實驗方案進行操作，實時熒光定量PCR檢測miR-30d的表達相對定量值；抑制表達和過表達 ARRDC3的蛋白表達量檢測采用蛋白免疫印跡法，通過SDS-PAGE分離含有40 μg蛋白質的提取物并轉移到Hybond硝酸纖維素膜上在含Tween-20的磷酸鹽緩沖液中搖動，用5%脫脂奶粉封閉，抗ARRDC3探針進行檢測，Super Signal West PICO化學發光檢測系統觀察結果。

2.Taylor數據庫分析

Taylor臨床前列腺癌組織基因芯片微列陣數據集（GSE21032，從NCBI的GEO公共基因芯片數據庫下載），主要用于分析ARRDC3 mRNA的表達情況。所有前列腺癌及BPH患者取材前均未經化學治療或放射治療，含有詳細臨床資料的150例前列腺癌及29例良性前列腺組織。臨床信息主要有年齡、病理分型、病理分組、Gleason評分、血清PSA、淋巴結轉移、生存及生化復發情況等信息。前列腺癌的納入標準：病理證實為前列腺癌，分期不限。BPH納入標準：病理診斷為BPH。排除標準：已作手術去勢者。將生化復發定義為：前列腺癌根治術后，未行輔助內分泌治療及放療的前提下，隨訪過程中連續2次血清PSA水平超過0.2 ng/ml。該數據庫已經剔除了死因為非前列腺癌及其他意外事故死亡的患者。

3.細胞轉染

按Lipofectermine 2000轉染試劑說明將miR-30d的shRNA和NC轉染至LNCaP細胞株中，ARRDC3的短發夾RNA（shRNA）和小干擾RNA（siRNA）以及各自相應空白對照物轉染至DU145、LNCaP細胞株，構建過表達及抑制細胞株，進行細胞增殖實驗、細胞侵襲實驗及細胞劃痕實驗。引物序列：實驗組中ARRDC3-1為TGTTGCTGGTTC-TGTACCTC， ARRDC3-2為AGCTTGTGGCTAACTTGCGT，ARRDC3-3為GCTTGTGGCTAACTTGCGTG；對照組為ACGGAGGCTAAGCGTCGCAA。

四、統計學處理

使用SPSS 19.0處理數據，連續變量以±s表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗。Kaplan-Meier法繪制生存曲線，生存曲線的對比采用Log-rank檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

結果

一、過表達或抑制miR-30d對ARRDC3 mRNA和蛋白表達水平的影響

實時定量PCR顯示，ARRDC3 mRNA表達水平在抑制表達miR-30d的LNCaP細胞株中上調（17.03±0.60 vs. 1.01±0.03，t=83.163、P<0.001），在過表達miR-30d的LNCaP細胞株中下調（0.10±0.05 vs. 1.00±0.03，t=-12.796、P<0.001），見圖1A。蛋白免疫印跡法也顯示同樣的結果（P<0.001），見圖1B。

二、ARRDC3表達水平與前列腺癌患者的臨床特征和預后的相關性

Taylor數據庫分析顯示，生化復發、術后發生轉移和高Gleason評分值者的ARRDC3 mRNA表達水平較低（P均<0.05），見表1。年齡、術前PSA水平、是否死亡和病理分期之間與ARRDC3的表達水平無關（P>0.05）。生存曲線顯示，與術后生化復發者相比，術后無生化復發ARRDC3 mRNA表達者高較高（P<0.05）；ARRDC3 mRNA表達水平與術后患者的總體生存率無關（P>0.05），見圖2。

1.細胞增殖實驗結果

LNCaP與DU145細胞中，與無過表達ARRDC3（NC組）比較，過表達ARRDC3（ARRDC3組）的OD450均較低（t分別為56.711、22.420，P均<0.001），見圖3A；與無抑制ARRDC3表達（KO-NC組）比較，抑制ARRDC3表達（KO-ARRDC3組）的OD450均較高（t分別為34.200、47.226，P均<0.001），見圖3B。

2.劃痕實驗結果

LNCaP與DU145細胞中，與NC組比較， ARRDC3組的移行細胞數均較少；與KO-NC組比較， KO-ARRDC3組的移行細胞數較多，見圖3C。

3.侵襲實驗結果

LNCaP與DU145細胞中，與NC組比較， ARRDC3組的穿膜細胞數均較少；與KO-NC組比較， KO-ARRDC3組的穿膜細胞數較多，見圖3D。

討論

腫瘤標志物指由腫瘤細胞產生或受腫瘤刺激后由機體其他組織、細胞異常表達的物質，目前血清學方法檢測腫瘤標志物已成為臨床普遍應用且簡便易行的理想檢測方法之一。對腫瘤標志物異常升高者進行的早期全面診斷及干預，可有效提高腫瘤患者的生存率。多項研究顯示，miR-30d表達水平在髓母細胞瘤、黑色素瘤、肝細胞癌、卵巢癌中上調，并可作為促癌基因及預測指標判斷腫瘤的預后、轉移風險和臨床進展[7-8]。我們前期在過表達miR-30d的基因表達譜分析中發現ARRDC3明顯下調。ARRDC3是哺乳動物α-抑制蛋白家族的成員之一，由N末端抑制蛋白葉、C末端抑制蛋白葉和含有2個PPXY基序的C末端尾組成[9]。ARR-DC3包含抑制蛋白結構域蛋白家族的結構同源性，研究表明ARRDC3與硫氧還蛋白互作蛋白（TXNIP）具有相同的抑制結構域，參與受體信號傳導及內吞作用[10]。另一研究顯示，ARRDC3在小鼠和人類細胞中也具有下調β2-腎上腺素能受體（β2AR）的作用，其主要定位于重組蛋白EEA1早期內體，它與ESCRT-0復合物相互作用，以不依賴配體的方式與β2AR結合并通過負調節β2AR進入循環回收小管，從而將其保留在EEA1-陽性早期內體，所以ARRDC3可調節受體依賴性G蛋白內體上的信號傳導[11-12]。Nabhan等[13]認為，ARRDC3主要作用于質膜，其與β2-AR相互作用以激動劑依賴的方式和功能促進泛素連接酶Nedd4介導的泛素化和隨后β2-AR的降解，進一步的研究顯示ARRDC3與含各種HECT-域E3泛素連接酶的WW結構域相互作用，ARRDC3的第1個PPxY基序已經顯示其與在體外具有高親和力Nedd4結構域的第三WW相互作用。本研究利用實時定量PCR和蛋白免疫印跡法驗證miR-30d與ARRDC3在前列腺癌中的調控關系，結果顯示miR-30d在前列腺癌中負調控ARRDC3，有關miR-30d負調控ARRDC3的機制及兩者的相互作用關系仍有待進一步深入研究探討。

目前，ARRDC3已經被證明在腫瘤中起抑癌作用。最近有關ARRDC3抑癌機制的研究表明，ARRDC3功能在于控制細胞表面黏附分子ITGβ4（腫瘤抑制蛋白）的新型調控途徑，ARRDC3與磷酸化的ITGβ4結合并導致其內化、泛素化和最終降解，ARRCD3-ITGβ4途徑可作為乳腺癌新的治療靶標[14]。有關ARRDC3在腫瘤方面的報道主要集中在其作為腫瘤抑制基因抑制乳腺癌的進展，而在前列腺癌方面的研究報道甚少。我們進一步使用前列腺癌臨床芯片數據集（Taloy數據庫）進行分析， 結果顯示生化復發、術后轉移和高Gleason評分值者ARRDC3 mRNA表達水平高，而低表達ARR-DC3者的術后生化復發率及術后轉移發生率低于高表達者，提示ARRDC3在前列腺癌中起抑癌作用，ARRDC3表達水平下調可導致前列腺癌患者術后出現臨床進展。生存分析顯示，ARRDC3 mRNA低表達者的術后無生化復發率低于高表達者，但ARRDC3 mRNA表達與患者總體生存率無關，這可能由于所研究的基因數據庫中前列腺癌患者的前列腺癌特異性病死率較低，影響了ARRDC3評估患者總體生存率的預測價值。

為了研究過表達和抑制表達的ARRDC3基因對前列腺癌細胞的增殖、遷移、侵襲等功能的影響，我們進行細胞功能實驗，包括細胞增殖實驗、劃痕實驗及侵襲實驗。結果表明，與對照組相比，無論是在雄激素依賴性（LNCaP）還是在非雄激素依賴性（DU145）前列腺癌細胞中，過表達ARRDC3均能夠抑制前列腺癌細胞的增殖、侵襲和遷移能力，抑制表達的ARRDC3能增強細胞的增殖、遷移和侵襲能力，證實ARRDC3能抑制前列腺癌細胞的增殖、遷移及侵襲，對前列腺癌細胞起著抑癌的作用。

綜上所述，ARRDC3為前列腺癌的抑癌基因，并與前列腺癌淋巴結轉移和術后生化復發有關，可作為前列腺癌進展和預后預測的標志物。有關ARRDC3抑制前列腺癌進展的下游調控基因或通路，以及是否存在ARRCD3-ITGβ4調控通路仍有待進一步的研究探討。

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（收稿日期：2018-01-17）

（本文編輯：林燕薇）