益氣逐瘀方改善心肌梗死大鼠心肌損傷及對miR24/Bim通路相關蛋白表達的影響

褚福永　劉巍　尚菊菊

摘要目的：探討益氣逐瘀方參元丹對急性心肌梗死大鼠心肌損傷及miR24/Bim通路相關蛋白表達的影響。方法：50只SD大鼠隨機分為假手術組、模型組、參元丹高、中、低劑量組，每組10只，采用左冠狀動脈前降支結扎法復制心肌梗死模型，參元丹高、中、低劑量組從術后第2天開始給予參元丹藥液灌胃，假手術組和模型組給予等劑量生理鹽水灌胃，共給藥2周。治療結束后檢測大鼠血清CK、LDH水平及心肌組織miR24基因表達，超聲心動圖檢測左室功能，Westernblot檢測心肌組織Bim、Bcl2、Bax、caspase9蛋白表達。結果：實驗結束時，與模型組比較，參元丹高、中、低劑量組均能顯著降低血清CK、LDH水平（P<005，P<001），升高心肌組織miR24基因表達（P<005，P<001），降低左室舒張和收縮末期內徑（P<005，P<001），升高左室短軸縮短率及射血分數（P<005，P<001），升高心肌組織Bcl2蛋白表達（P<005），降低Bim、Bax、caspase9蛋白表達（P<005，P<001）。結論：益氣逐瘀方參元丹可能通過調控miR24/Bim信號通路相關細胞因子蛋白表達改善心肌梗死細胞損傷。

關鍵詞益氣逐瘀方；參元丹；細胞梗死；miR24

Effects of Yiqi Zhuyu Formula on Improving Cardiac Injury and miR24/Bim Signal Pathway Related Protein Expression in Myocardial Infarction Rats

Chu Fuyong，Liu Wei，Shang Juju，Liu Hongxu

（Beijing Hospital of Traditional Chinese Medicine，Capital Medical University，Beijing 100010，China）

AbstractObjective：To investigate the effects of Yiqi Zhuyu formula Shenyuan Dan （SYD） on myocardium injury biomarkers，cardiac function，miR24/Bim pathway protein expression in myocardial infarction rats.Methods：Fifty SD rats were randomly divided into five groups namely sham group，model group，high，middle，and lowdose SYD group，with 10 rats in each group.The rat myocardium ischemia model was established by ligating of anterior descending branch of coronary artery.The rats in treatment groups were performed with intragastric administration of SYD for 2 weeks.After the treatment，serum levels of creatine kinases （CK），lactate dehydrogenase （LDH），and cardiac function were measured.miR24 mRNA expression was measured by RTPCR.Bim，Bcl2，Bax and caspase9 protein expression in ischemic myocardium were measured by Westernblot.Results：At the end of the treatment，the serum levels of CK，LDH were significantly decreased in SYD （high，middle and lowdose） groups compared with those in model group （P<005，P<001）.The cardiac function was also improved with the LVEDD and LVESD significantly decreased （P<005，P<001），and the LVFS and EF significantly increased （P<005，P<001）.The expression of miR24 mRNA and Bcl2 protein in ischemic myocardium were significantly increased and the Bim，Bax，caspase9 protein were significantly decreased in SYD groups compared with those in model group （P<005，P<001）.Conclusion：Yiqi Zhuyu formula SYD could relieve myocardial injury and the possible mechanism may be related to adjusting miR24/Bim signal pathway and its related protein expression in ischemic myocardium.

Key WordsYiqi Zhuyu formula； Shenyuan Dan； Myocardial infarction； miR24

中圖分類號：R242；R256；R2855文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.08.005

冠心病發病的主要病理過程是心肌缺血，細胞凋亡是缺血早期細胞損傷的重要病理機制[12]。研究表明，miR24在心肌組織中高表達，并且能夠通過調控下游Bim/caspase凋亡信號通路發揮心肌保護作用[3]。課題組前期研究發現，基于益氣逐瘀法組方的參元丹（SYD）具有減輕心梗大鼠心肌損傷程度，上調缺血心肌組織miR24表達的作用[46]，然而其通過干預miR24介導的下游Bim/caspase信號通路發揮心肌保護作用的具體作用機制尚不清楚。本研究通過觀察SYD對心肌梗死大鼠心肌損傷標志物、心功能、miR24/Bim通路相關蛋白表達的影響，探討SYD改善心肌缺血細胞損傷的作用機制。

1材料與方法

11材料

111動物健康清潔級SD大鼠50只，體重（220±10）g，雌雄不限，購自北京市維通利華實驗動物有限公司，合格證號：SCXK（京）20132014。嚴格控制飼養條件，自由飲食，光照時間6：00～18：00，明/暗周期為12 h/12 h，溫度（20±3）℃，背景噪聲（40±10）db。

112藥物SYD由丹參、黨參、玄參、地龍、土鱉蟲等組成，來源于北京中醫醫院中藥制劑室。根據課題組前期研究資料[4]，將SYD除去包衣，溶于蒸餾水中，以10倍量常水煮提3次，30 min/次，合并煮提液，濃縮至含生藥1 g/ mL的藥液供用。

113試劑與儀器Trizol（Invitrogen）、MMLV逆轉錄酶（Promega），miR24逆轉錄試劑盒TransStart Green qPCR superMix（北京全式金生物技術有限公司），引物設計由Invitrogen公司完成，Bax、Bim、Bcl2、caspase9多克隆抗體（英國Abcam公司），辣根過氧化物酶標記羊抗兔二抗（美國Santa Cruz），GAPDH抗體（美國Santa Cruz）。小動物呼吸機（成都泰盟科技），全自動生化分析儀（美國BECKMAN），臺式高速冷凍離心機（德國Eppendorf），ABI 7300 Real time PCR儀（美國ABI），Thermo NanoDrop 2000型分光光度計（美國Thermo），倒置熒光顯微鏡（日本Olympus），-80 ℃超低溫冰箱（美國Thermo），TA1003型精密電子天平（上海天平儀器）。

12方法

121分組與模型制備采用冠狀動脈前降支結法扎建立大鼠心肌缺血模型，具體方法參照課題組前期研究結果進行[4]，假手術組開胸后只穿線不結扎，術后每只大鼠給予青霉素鈉20萬U/d肌注預防感染。動物適應性喂養3 d，禁食12 h后進行隨機分為假手術組（Sham）、模型組（Model）、SYD高劑量組（HSYD）、SYD中劑量組（MSYD）、SYD低劑量組（LSYD），每組10只。

122給藥方法從術后第2天開始給藥，連續給藥14 d。其中，SYD高、中、低劑量組分別按照12 g/（kg·d）、6 g/（kg·d）、3 g/（kg·d）給予SYD藥液灌胃，假手術組和模型組分別給予等劑量的生理鹽水灌胃。

123檢測指標與方法實驗結束時，大鼠戊巴比妥鈉麻醉，腹主動脈取血3 mL，分離血清。采血后大鼠麻醉處死，去除心房及右心組織，于結扎點以下沿心臟縱軸方向分別橫切三份3～5 mm心肌組織，分裝入DEPC處理的EP管后放入液氮中，-80 ℃超低溫冰箱保存待檢。全自動生化分析儀檢測大鼠血清CK、LDH水平。超聲心動圖檢測大鼠心功能，采用GE VIVID7超聲顯像儀（探頭頻率13MHz）于胸骨旁二維短軸平乳頭肌水平采集左心室圖像，測量左心室舒張期末內徑（LVEDD）、左心室收縮期末內徑（LVESD）、短軸縮短率（FS）及左心室射血分數（LVEF）。采用Real timePCR法檢測心肌組織miR24 mRNA表達，以U6作為內參。心肌組織總mRNA提取參照Trizol試劑盒說明進行，每個樣本取400 ngRNA模板合成cDNA。miR24引物序列：上游5′GCGGCGGTG GCTCAGTACA GC3′，下游5′GTGCAGGGTCCGAGGT3′；內參U6引物序列：上游5′GCTC GCTTCG GCAGCACA3′，下游：5′GAGGTA TTCGCACCAGAGGA3′，PCR反應條件：93 ℃2 min預變性，93 ℃1 min，55 ℃1 min，72 ℃1 min，工作40次循環，最后72 ℃7 min延伸，反應結束后，通過產物的溶解曲線判定引物的特異性。調整基線和閾值讀出各孔的循環數（Cycle Threshold，Ct），利用比較Ct法檢測各樣本mRNA的表達情況。Western blot檢測心肌組織Bim、Bax、Bcl2、caspase9蛋白表達Western blot檢測心肌組織Bim、Bax、Bcl2、caspase9蛋白表達，取30 mg心肌組織經過勻漿、裂解、超聲破碎、高速離心后，取上清，采用考馬斯亮藍法在分光光度儀上測定蛋白濃度，分裝后-20 ℃保存，為避免免疫印跡實驗中標本蛋白量不同造成的影響，上述受體的免疫印跡結果用GAPDH進行校正。采用ImagePro Plus 41軟件分析蛋白條帶的吸光度[integrated absorbance，IA=平均吸光度（A）×面積]，以靶蛋白IA與GAPDH IA的比值反映靶蛋白水平。

13統計學方法采用SPSS 150進行統計分析，所有數據以（±s）表示，計量資料組內比較采用配對t檢驗，組間比較采用ANOVA方差分析，以P<005為差異有統計學意義。

2結果

21各組大鼠血清CK、LDH水平及心臟功能參數比較與假手術組比較，模型組大鼠血清LDH、CK明顯升高（P<001），SYD高、中、低劑量組均能顯著降低AMI大鼠血清CK、LDH濃度（P<005，P<001），且呈一定量效關系。見表1。與假手術組比較，模型組大鼠LVEDD、LVESD明顯升高（P<001），FS、EF明顯降低（P<001）。SYD高、中、低劑量均能夠顯著降低模型大鼠LVEDD、LVESD水平，升高FS，EF水平，與模型組比較，差異有統計學意義（P<005，P<001）。見表2。

22大鼠心肌組織miR24基因表達比較與假手術組比較，模型組大鼠心肌組織miR24表達水平顯著下降（P<001）。SYD高、中、低劑量組均能夠升高心梗大鼠心肌組織miR24表達，其中，SYD高、中劑量組和模型組比較，差異有統計學意義（P<005，P<001）。見表1。

23大鼠心肌組織Bim、caspase9、Bax、Bcl2蛋白表達比較與假手術組比較，模型組大鼠Bim、caspase9、Bax、Bcl2蛋白表達均明顯升高（P<005）。SYD高、中、低劑量均能夠顯著降低大鼠Bim、Bax、caspase9水平，升高Bcl2水平，與模型組比較，差異有統計學意義（P<005，P<001）。見表3、圖1。

3討論

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病是最常見的人類死亡病因之一，其基本的病理生理過程是心肌缺血[7]。細胞凋亡是心肌缺血早期細胞損傷的重要病理機制，近來研究表明， miR24在哺乳動物心肌組織中高表達，并且在小鼠心肌缺血早期表達明顯上調，并可能通過調控靶基因Bim及其下游線粒體細胞凋亡信號通路關鍵細胞因子基因和蛋白的表達參與了缺血心肌自身修復過程[89]；此外，我們前期的臨床研究也發現，不穩定型心絞痛（UAP）和急性心肌梗死（NSTEMI、STEMI）患者外周血 miR24表達水平明顯低于穩定型心絞痛和健康人群，miR24的表達與炎性反應和細胞凋亡因子呈明顯的負相關，且隨著冠脈病變支數和嚴重程度的增加，miR24的表達水平呈下降趨勢[10]。由此可見，miR24與冠心病發病過程關系密切，miR24在冠心病心肌缺血發病過程中可能發揮了重要的調控作用。

本研究表明，心肌梗死后大鼠心肌組織由于缺血缺氧刺激，心肌損傷標志物CK、LDH和細胞凋亡水平明顯升高，miR24表達明顯降低，通過調控靶基因Bim及下游凋亡因子Bax、Bcl2、caspase9表達參與調控細胞凋亡。參元丹能夠有效降低心肌梗死大鼠血清CK、LDH的水平，改善心功能，通過上調miR24其下游抑凋亡因子Bcl2表達水平，下調Bim及其下游促凋亡因子Bax、caspase9表達水平發揮減輕心肌缺血細胞損傷的作用，且呈一定量效關系。本研究初步證實了參元丹具有減輕心梗大鼠心肌細胞損傷及細胞凋亡的作用，其機制可能與其上調心梗大鼠缺血區miR24表達，從而抑制其靶基因Bim及下游促凋亡因子Bax、caspase9基因表達有關。本研究將為益氣逐瘀法在冠心病心肌缺血中的應用提供實驗依據，也為臨床上探尋冠心病新的治療方法和藥物靶點提供思路。

參考文獻

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（2018-07-20收稿責任編輯：徐穎）