利用輻射誘變技術創制抗稻瘟病紫葉兩系水稻新材料

吳孝波,馮 慧，黃 強,劉勇強,姬紅麗,楊 芳,劉育生,彭云良*,楊成明

(1.四川省原子能研究院，四川 成都 610101;2.四川省農業科學院植物保護研究所，四川 成都 610066)

水稻是我國重要的糧食作物，提高水稻產量是水稻生產育種的重要課題，受到多種環境脅迫的影響，其中由稻瘟菌(Magnaportheoryzae)引起的稻瘟病就是危害最大的生物脅迫。稻瘟病的大面積爆發對我國的糧食安全就會造成重大隱患，近年來，兩系雜交水稻因產量優勢強，且生產成本更低而得到大面積推廣。因此提高兩系水稻對稻瘟病的抗性一直以來都是水稻抗病育種的重要課題。在生產上，水稻生產的方式也發生了較大的變化，工廠化育苗已形成發展趨勢。具有標記性狀的雜交水稻的應用，有利于保證田間純度進而提高產量。

稻瘟病在我國是水稻生產上的最重要的病害之一。2007年，湖北來鳳縣穗頸瘟的大流行，造成了水稻嚴重減產，產量損失在20%～80%，嚴重的顆粒無收，給農民造成了巨大的經濟損失[1]。2014年，受極端氣候、品種抗性、栽培措施和防控效果等因素影響，稻瘟病在我國局部稻區突發流行，全國發病面積513.6萬hm2，造成實際損失55.8萬t。尤其在長江中下游稻區，這次稻瘟病發生為近20年來最重、發生面積之大、發生程度之重均為歷年罕見[2]。實踐證明，選育和種植抗病品種是防治稻瘟病最經濟有效的措施。利用分子標記輔助選擇方法來選擇抗稻瘟病材料的報道已較多。官華忠等(2006)報道了通過標記輔助連續回交方法將顯性廣譜抗稻瘟病基因Pi-9導入到金山B-l中[3]。文紹山等(2012)報道了采用雜交和分子標記輔助選擇技術，將水稻廣譜高抗稻瘟病基因Pi-9(t)導入雜交水稻恢復系瀘恢17，再利用抗稻瘟病基因Pi-9(t)的特異分子標記pB8檢測該目的基因，獲得68份攜有Pi-9(t)基因型的回交株系[4]。裘燁等(2018)報道了通過分子標記技術，利用攜帶廣譜抗稻瘟病基因Pi-kh的Tetep為親本來改良R1，R2的稻瘟病抗性，得到了在田間鑒定有較高稻瘟病抗性的改良恢復系[5]。因此，選育稻瘟病抗性好的水稻品種就顯得尤為重要。

不論兩系、三系均存在育性不穩定現象，尤其是兩系不育系因其本身的育性受環境條件影響較大，易自交結實而影響制種純度。由于四川省的特殊生態環境造成兩系雜交稻制種風險較大。為了解決適合四川兩系雜交稻制種和水稻不育系的育性不穩定的問題，保證生產用種的純度，將隱性紫葉標記性狀導入兩用系S，容易在苗期進行有效辨識和剔除。為此，為了將紫葉標記性狀和Pi-9、Pi-kh基因導入兩系材料，我們采用輻射誘變技術、MAS技術和雜交技術相結合的方法，期望獲得具有持久稻瘟病抗性的帶紫葉標記性狀的水稻兩用系S材料，以選育出能在四川制種的兩系抗病雜交水稻新品種。

1 材料與方法

1.1 材料

親本材料川香29B、II-32B、P88S、C815S和參考材料廣占63S、內香2B由四川省原子能研究院提供；IR22(IRBL9)、IR8(IRBLkh-K3)由四川省農業科學院植保所提供給；紫S由貴州省農業科學院水稻所提供。

1.2 DNA提取及PCR擴增

采用TPS法提取水稻葉片總DNA。Pi-Kh檢測用引物為K5-F/K5-R,K6-F/K7-R,K8-F/K8-R。Pi-9位點檢測用引物為NBS/PIR。PCR反應體系為25μl，1μl模板DNA，各引物0.5μl(10 mmol·L-1)，12.5μl 2×Taq Mix酶，ddH2O補足25μl。PCR反應程序為：①94℃ 預變性5min。②94℃變性40s。③55℃(NBS/PIR，K8-F/K8-R)，57℃(K5-F/K5-R，K6-F/K7-R)退火1min。④72℃延伸1.5min；重復②～④共35個循環。⑤72℃聚合10min。⑥12℃保溫。擴增產物在1%瓊脂糖凝膠電泳上鑒定。

1.3 PCR產物測序及分析

采用sanger測序法，由成都擎科梓熙生物技術有限公司3730xl DNA Analyzer測序儀上完成，測序結果使用軟件MEGA7分析，選擇Neighbor-Joining法。

圖1 5500S和5514S的選育示意圖

在四川省農科院植保所稻瘟病病圃進行田間抗性鑒定，并將其中選擇的優系同時進行室內檢測抗病基因，其中5500S和5514S田間抗性和綜合農藝性狀表現很好。

2 結果與分析

2.1 兩用系5500S和5514S的選育

用含抗稻瘟病基因Pi-9和Pi-kh的單基因系IR22、IR8分別與P88S配制雜交F1代，二者再雜交形成F1代，并用480Gy劑量、72Gy/h劑量率的γ射線輻照雜交種子(種子水分12.0%)得到M1F1代，并用M1F1代與C815S雜交形成F1代，并在四川、海南連續加代得到F4代；用P88S和川香29B雜交的F6代與紫S雜交得到F1代種子，并用劑量480Gy、劑量率72Gy/h的γ射線輻照F1代種子(種子水分12.0%)，在四川、海南連續加代得到M4F5代；二者再雜交得到F1代，經過連續加代，在F5代將這兩個S材料在四川省農科院植保所邛崍抗病鑒定基地進行田間自然誘發鑒定，同時委托四川省農科院植保所進行室內抗稻瘟病基因檢測，最后得到兩用系S新材料5500S和5514S。其選育過程見圖1。

2.2 特征特性

5500S，開花習性好，柱頭外露率高，柱頭雙露率達75%左右。在四川綿竹播抽期85d左右，株高84cm左右，莖稈粗壯，抗倒力強。葉片紫色，分蘗力強，平均每穗穎花數183個左右。

5514S，開花習性好，柱頭外露率高，柱頭雙露率達72%左右。在四川綿竹播抽期85d左右，株高83cm左右，莖稈粗壯，抗倒力強。葉片紫色，分蘗力中等，平均每穗穎花數195個左右。

2.3 田間抗性鑒定

經由四川省農科院植保所在其邛崍基地進行稻瘟病抗性鑒定。按照田間自然誘發稻瘟病調查方法、病情分級和記載標準進行，結果為：5500S和5514S兩個材料的葉瘟為4～5 級，穗頸瘟為3～5級，而對照F優498的葉瘟和穗頸瘟均為9 級(表1)，說明這2個兩用不育系水稻新材料都具有很好的抗性。

表1 5500S和5514S及F優498在邛崍的稻瘟病鑒定(2017)

2.4 抗性基因檢測

由圖2～5可以得出，5500S、5514S含有Pi-Kh基因和Pi-9位點的一個新等位基因，其中Pi-Kh基因與IRBL kh-K3、C815S有關，而Pi-9等位基因則來自于P88S。

圖2 不育系5500S和5514S中Pi-9基因擴增產物電泳圖

條帶1：川香29B，條帶2:II-32B，條帶3:P88S，條帶4:廣占63S，條帶5：內香2B，條帶6：C815S，條帶7～11：5500S，條帶12～16：5514S，條帶17： IRBL9，條帶18：M2-9-14UL，條帶19：Co39，條帶20：LTH，條帶21：ddH2O；其中川香29B 、II-32B 、P88S 、C815S為親本，IRBL9為正對照，M2-9-14UL為負對照，CO39和LTH為感病對照。引物NBSF/PIR，PCR產物大小約2.9kb。

圖3 利用Pi-9等位基因和檢測樣品測序結果系統發育樹

圖4 不育系5500S和5514S中Pi-Kh基因擴增產物電泳圖

條帶1：川香29B，條帶2：II-32B，條帶3：P88S，條帶4：廣占63S，條帶5：內香2B，條帶6：C815S，條帶7～11：5500S，條帶12～16：5514S，條帶17：IRBLkh-K3，條帶18：M2-9-14UL，條帶19：CO39，條帶20：LTH，條帶21：ddH2O；其中川香29B、II-32B、P88S、C815S為親本，IRBLkh-K3為正對照，M2-9-14UL為負對照，CO39和LTH為感病對照，LTH含Pi-Kh基因，但因位點突變，不表現抗病性。引物K5-F/K5-R，PCR產物大小約1.7kb，引物K6-F/K7-R，PCR產物大小約2.3kb。

圖5 Pi-Kh等位基因和檢測樣品測序結果系統發育樹

3 結論

通過輻射誘變技術、MAS技術與雜交技術創制出的帶紫葉標記性狀的水稻材料5500S和5514S，開花習性好，柱頭外露率高，莖稈粗壯，抗倒力強，田間誘發稻瘟病抗性表現頸瘟3-5級。這2個材料中，含有Pi-Kh基因和Pi-9位點的一個新等位基因。這可以為今后培育兩系雜交水稻抗病品種打下基礎。這2個帶隱性紫葉標記性狀的、含Pi-Kh和Pi-9抗稻瘟病基因的兩用系的成功創制，不僅可以簡單而有效地保證水稻大田生產純度進而提高質量，同時也可以為選育新的抗病兩系雜交水稻新組合提供重要的親本來源。