CD44v6、Transgelin、Transgelin2在結直腸癌的表達及預后意義

曹永 鄭慧哲 金在順 呂強（通訊作者） 高曉虹（通訊作者）

（1遵義醫學院法醫病理教研室 貴州 遵義 563099）

（2牡丹江醫學院紅旗醫院 黑龍江 牡丹江 157011）

（3牡丹江醫學院基礎醫學院 黑龍江 牡丹江 157011）

（4遵義醫學院生理教研室 貴州 遵義 563099）

結直腸癌（Colorectal cancer，CRC）是一種多基因疾病，由抑制基因、致癌基因、錯配修復基因以及細胞周期調控基因的改變引起[1]。雖然近年相繼報道了一些腫瘤干細胞標記物如CD133、CD44等以及結直腸癌預后相關分子標記物如IMP3、S100A2等[2]，但隨著干細胞標記物的深入研究證實多種惡性腫瘤的發生發展都與CD44v6有密切關系[3]，CD44v6是最早發現的一種CD44粘附分子，在腫瘤侵襲、轉移過程中起重要促進作用[4]，但CD44v6是否可作為獨立判斷結直腸癌預后標記物的研究報道甚少。因此，本研究擬聯合檢測CD44v6和Transgelin、Transgelin2在結直腸癌中的表達，并分析其與臨床病理特征及對預后生存的影響。

1.材料與方法

1.1 材料

收集徐州醫學院附屬醫院（2005～2008年）資料完整的原發性結直腸癌112例及相應癌旁組織，男62例，女50例，年齡21～87歲，平均53.6歲，病例依據（AJCC）TNM分期標準：Ⅰ、Ⅱ期59例，Ⅲ、Ⅳ期53例，低分化32例，高-中分化80例（表1）。實驗標本征得徐州醫學院附屬醫院倫理委員會同意。

1.2 試劑和方法

標本制成組織微陣列（tissue microarray，TMA），厚4um連續切片，采用S-P（streptavidin-perosidase）試劑盒（福州邁新）檢測3種抗體：CD44v6（ABD serotec，貨號∶MCA1730）、Transgelin（Proteintech，貨號：10493-1-AP）和Transgelin2（Proteintech，貨號：10234-2-AP）。Transgelin、Transgelin2（1∶150稀釋）、CD44v6（1∶200稀釋），用0.01mol/L枸櫞酸鹽酸緩沖液（pH6.0）高溫高壓法行抗原修復，PBS液代替一抗做空白對照。

1.3 結果判定

分析陽性細胞占同類細胞的百分比及陽性細胞的著色強度，判斷免疫組化結果。三種蛋白均成棕褐色表達，CD44v6線性表達于細胞膜，Transgelin顆粒狀表達于細胞核，Transgelin2顆粒狀表達于胞漿；每例標本觀察5個視野（400倍），計算陽性細胞數，染色強度：無染色為0，輕度染色為1，中度染色為2，強染色為3；陽性細胞所占百分比：0分為陽性細胞＜10%，1分為10%～30%，2分為30%～50%，3分為50%～70%，4分為70%～100%，兩種積分相乘，依照0為陰性（-），1～3為弱陽性（+），4～8為陽性（++），9～12為強陽性（+++）。免疫組化結果由兩名病理科醫生獨立判讀，判讀結果不一致時，由第三方病理醫生參與協商做出判讀。

1.4 統計學處理

采用SPSS17.0和Stata12.0進行統計分析，分別用以秩和檢驗、Pearman相關分析、Kaplan-Meier生存分析、Cox模型分析。

2.結果

2.1 CD44v6、Transgelin、Transgelin2 表達

三種蛋白均為棕褐色表達，CD44v6在112例結直腸癌中陽性表達74例（66.1%），呈線性分布于癌細胞膜，癌巢及周邊區域表達明顯增強（圖1-A、B、C、D），癌旁無表達。Transgelin有94例（83.9%）陽性表達，呈顆粒狀表達于細胞核，（圖1-E、F、G、H），癌旁間質偶有表達。Transgelin2有71例（63.4%）呈棕褐色顆粒表達于癌細胞漿，（圖1-I，J、K、L），癌旁組織偶有表達。

圖1 CD44v6、Transgelin和Transgelin2免疫組化染色

2.2 Transgelin、Transgelin2、CD44v6表達與結直腸癌臨床病理特征的關系

CD44v6與結直腸癌腫瘤大小（χ2=22.002，P=0.000）、AJCC分期（χ2=30.023，P=0.000）、組織學分級（χ2=14.638，P=0.002）、淋巴結轉移（χ2=34.504，P=0.000）密切相關；Transgelin與組織學分級（χ2=22.409，P=0.000）、淋巴結轉移（χ2=7.932，P=0.047）顯著相關；Transgelin2與AJCC分期（χ2=32.594，P=0.000），淋巴結轉移（χ2=12.406，P=0.006）顯著相關。

2.3 CD44v6、Transgelin、Transgelin2的相關關系

結直腸癌中Transgelin 和Transgelin2為負相關性（r=-0.228，P=0.016），Transgelin和CD44v6無相關性（P＞0.05），Transgelin2和 CD44v6呈正相關（r=0.556，P=0.000），Transgelin2和CD44v6在結直腸癌中起相互促進作用。

2.4 CD44v6、Transgelin、Transgelin2表達與各臨床病理參數對患者預后影響

Kaplan-Meier生存分析如圖2示，CD44v6陽性患者術后五年生存率明顯低于陰性患者（P=0.000）（圖2-i），而Transgelin、Transgelin2表達患者術后五年生存率與陰性患者無顯著差異（P=0.386，P=0.982）（圖2-g，h）；腫瘤大小，AJCC分期，組織學分級，淋巴結轉移（圖2-c，d，e，f）均與預后明顯相關（P=0.000），而性別、年齡與生存無關（P=0.956，P=0.508）（圖2-a，b）。

圖2 CD44v6、Transgelin、Transgelin2與臨床病理特征的Kaplan-Meier分析

2.5 Cox模型分析

經Cox分析顯示：腫瘤大小[HR（95%CI）：0.573（0.361～0.908）；P=0.018]、組織學分級（Poor）[HR（95%CI）：13.408（5.330～33.728）；P=0.000]、AJCC 分期（Ⅲ+Ⅳ）[HR（95%CI）：5.051（2.959～8.621）；P=0.000]、 CD44v6[HR（95%CI）：0.277（0.131～0.587）；P=0.001]均可作為判斷結直腸癌預后的指標。（HR：hazard ratio；CI∶confidence interval）

3.討論

人類CD44基因因其結構中外顯子的差異分為：CD44（s）標準型和CD44（v）變異型[5]，而CD44v6是最早發現的一種CD44粘附分子，在腫瘤細胞侵襲、轉移過程中起重要促進作用[4，6]。已證實乳腺癌等多種腫瘤的侵襲轉移都與CD44v6有密切關系[3]。Matilde Todaro等[7]發現CD44v6可能是一個功能性生物標記分子又是結直腸癌干細胞治療性靶點之一。本研究發現結直腸癌中CD44v6表達顯著高于癌旁組織，并且CD44v6表達與腫瘤大小、AJCC分期、組織學分級及淋巴結轉移均關系密切，并隨著腫瘤細胞分裂增多，癌巢周邊其陽性表達增強，可能與腫瘤干細胞分裂旺盛及蛋白表達增多相關。本研究通過Kaplan-Meier和Cox分析發現，CD44v6表達患者術后五年生存率明顯低于陰性患者，進一步明確CD44v6可作為判斷結直腸癌預后的獨立標記物。

Transgelin也被稱為SM22[6-8]、轉膠蛋白等，并證實存在于細胞骨架中[9]，Transgelin可通過抑制HT1080細胞中MMP9表達而抑制細胞轉移[10]。Transgelin2是Transgelin的同系物，其具體功能作用機制不詳。本研究發現Transgelin表達與組織學分級、淋巴結轉移關系密切，Transgelin2與結直腸癌AJCC分期，淋巴結轉移顯著相關，預后分析顯示，Transgelin和Transgelin2都不可作為判斷結直腸癌預后的標記物，但可作為評判腫瘤進展能力的指標。研究還發現癌組織中Transgelin和Transgelin2的表達均比正常組織增強，其研究結果與Shields JM[11]、Kaplan-Alberquerque[12]等的研究結論不同，同時揭示，Transgelin和Transgelin2在結直腸癌中呈負相關，即二者在腫瘤發生發展中呈相互抑制作用，這在以前研究結果中鮮有報道。至于Transgelin和Transgelin2在不同惡性腫瘤中表達的不同以及功能的差異，可能因樣本量、地區差異、實驗試劑等多方面因素導致。

CD44v6和Transgelin2表達呈正相關，說明CD44v6和Transgelin2的協同表達在腫瘤發生、發展過程中起相互促進作用，此結果與Lee等[13]報道轉膠蛋白可促進腫瘤干細胞的侵襲和遷移，腫瘤細胞中轉膠蛋白的表達量高于非腫瘤細胞中的25倍相符，研究結果進一步證實轉膠蛋白具有促進腫瘤干細胞侵襲和遷移的功能。轉膠蛋白在結直腸癌中即促進腫瘤的發展又與CD44v6相互作用影響腫瘤惡性進展，但其作用機制尚不清楚。

綜上所述，CD44v6可作為獨立判斷結直腸癌預后的生物標記物，而Transgelin和Transgelin2可作為評判腫瘤進展能力的參考指標。在后續實驗中將進一步探討三者在分子通路中的相關作用機制。