分子生物學技術在結核病診斷及耐藥檢測中的應用

宮俐 韓中波

（吉林市結核病防治研究所 吉林 吉林 132011）

Xpert Mtb/RIF技術使用半定量巢氏熒光PCR，該技術針對結核桿菌利福平耐藥基因rpoB基因區設定引物、探針，擴增熒光檢測，其是否發生基因突變，檢測標本中是否含有結核桿菌及是否對利福平耐藥，整個實驗過程需3小時左右。線性探針雜交技術（Hain）檢測技術直接從臨床收集的病人肺部涂片陽性痰標本中提取核酸DNA、用生物素標記的引物進行多重PCR擴增和反向雜交。通過檢測rpoB基因突變（編碼RNA聚合酶β-亞單位）確定對利福平的耐藥性；通過檢測katG基因（編碼過氧化氫酶）和inhA基因的啟動子區（編碼NADH烯酰酸性磷酸酶還原酶）確定對異煙肼的耐藥性。從而，對來自培養物或病人肺部涂片陽性痰標本的結核分枝桿菌復合群及其耐利福平和/或異煙肼耐藥基因進行分子生物學檢測。

1.資料和方法

1.1 標本來源

2015年10月至2018年6月期間吉林市結核病防治研究所及所轄各縣區結防所收治的疑似結核病患者共1345份痰標本。

1.2 檢測方法

對1345份痰標本進行熒光染色涂片鏡檢檢測、結核分枝桿菌培養、結核桿菌比例法藥敏，相關操作及結果判定。其操作均按《結核病診斷細菌學檢驗規程》進行。

臨床確診肺結核病442例，對442例患者痰標本進行Xpert Mtb/RIF檢測和線性探針雜交技術（Hain）檢測，其操作均按試劑說明書進行。

2.結果

2.1 1345例初診肺結核可疑患者，經X線、CT、實驗室檢查，臨床最終確診肺結核病442例，確診率為32.9%。

2.2 Xpert Mtb/RIF檢測及線性探針雜交技術（Hain）檢測結核桿菌應用價值的評價

對442例肺結核患者痰標本進行涂片鏡檢，改良羅氏培養陽性率分別為24.4%（108/442）、42.3%（187/442），對442例肺結核病人痰標本進行Xpert Mtb/RIF檢測、線性探針雜交技術（Hain）檢測陽性率分別為49.5%（219/442）、44.8%（198/442）。Xpert Mtb/RIF檢測陽性率略高線性探針雜交技術（Hain）檢測，兩種分子生物學方法檢測陽性率明顯高于涂片鏡檢，改良羅氏培養法。

2.3 Xpert Mtb/RIF檢測利福平耐藥

Xpert Mtb/RIF檢測結果報告時間只需2～3小時，遠遠低于培養（2個月）、培養藥敏（3個月）的報告時間。Xpert Mtb/RIF檢測利福平耐藥與傳統方法比較，敏感度為90.2%、特異性為97.0%。見表1。

表1 Xpert Mtb/RIF檢測利福平耐藥與傳統方法比較

2.4 線性探針雜交技術（Hain）檢測利福平、異煙肼耐藥

檢測結果報告時間需2～3天，遠遠低于培養（2個月）、培養藥敏（3個月）的報告時間。線性探針雜交技術（Hain）檢測利福平耐藥與傳統方法比較，敏感度為88.0%、特異性為95.4%。檢測異煙肼耐藥與傳統方法比較，敏感度為73.7%、特異性為90.3%。見表2。

表2 線性探針雜交技術（Hain）檢測利福平耐藥與傳統方法比較

3.討論

近年來，Xpert Mtb/RIF檢測系統逐漸在基層推廣使用、線性探針雜交技術（Hain）在具有條件地市級實驗室推廣，本文對Xpert Mtb/RIF檢測技術、線性探針雜交技術（Hain）在檢測臨床標本診斷結核病及利福平、異煙肼耐藥檢測中的應用價值進行評價。

Xpert Mtb/RIF核酸檢測采用美國公司GeneXpert檢測系統，是一種半巢式實時定量熒光PCR體外擴增技術，針對利福平耐藥rpoB基因81bp核心區間（RRDR）設計相關引物、核酸探針，檢測相關基因是否發生突變，進而診斷是否結核桿菌感染以及是否對利福平耐藥。本研究Xpert Mtb/RIF檢測陽性率為49.5%，高于涂片鏡檢、結核桿菌培養法的陽性檢出率，且時間遠遠小于培養（6～8周）。Xpert Mtb/RIF檢測利福平耐藥與傳統方法比較，敏感度為90.2%、特異性為97.0%。表明Xpert Mtb/RIF技術檢測結核桿菌具較高有的臨床應用價值，可以對肺結核的診斷及合理規范治療起到重要作用。線性探針雜交技術（Hain），從培養物或直接從臨床收集的病人痰標本中提取核酸DNA、用生物素標記的引物進行多重PCR擴增和反向雜交。雜交包括下列步驟：擴增產物的變性，單鏈雜交、生物素標記的擴增產物與膜上的探針雜結合、嚴格漂洗、與鏈霉親和素/堿性磷酸酶（AP）標記物孵育、堿性磷酸酶介導的顯色反應，判讀模板，便于對所獲帶型簡易、快速做出解釋。實驗只需3天時間，即可檢測出結核桿菌及利福平和異煙肼是否耐藥。線性探針雜交技術（Hain）檢測結核分支桿菌陽性率為44.8%，線性探針雜交技術（Hain）檢測利福平耐藥與傳統方法比較，敏感度為88.0%、特異性為95.4%。檢測異煙肼耐藥與傳統方法比較，敏感度為73.7%、特異性為90.3%。

Xpert Mtb/RIF檢測技術、線性探針雜交技術（Hain）均是世衛組織認可的結核病快速檢測新方法，Xpert Mtb/RIF檢測技術具有簡單、快捷，只需3小時左右即可得到報告；生物安全要求低，具備生物安全柜就可操作，具有較高的陽性檢出率，Xpert Mtb/RIF檢測利福平耐藥與傳統比例法藥敏進行比較，敏感性和特異性均較高，在基層結核病防治機構具有較高的應用價值。研究表明，線性探針雜交技術（Hain）可快速、準確鑒定結核分枝桿菌并對利福平、異煙肼耐藥基因進行檢測,適用于檢測結核菌株和痰標本，可大幅縮短藥物敏感試驗時間,有利于指導臨床用藥治療。但該技術對實驗室有嚴格要求，需要在通過認證的PCR實驗室進行試驗，更適合在市級結核病PCR實驗室進行推廣。