一株銀耳污染菌的分離鑒定及其生長條件研究

邱希斌

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一株銀耳污染菌的分離鑒定及其生長條件研究

邱希斌1,2

（1. 福建省產品質量檢驗研究院，國家加工食品質量監督檢驗中心，福建 福州 350002； 2. 福建農林大學食品科學學院，福建 福州 350002）

對生產中在銀耳子實體表面發現的一種產紅色色素的污染菌進行分離，經形態學和分子水平分類鑒定為絲枝蠟蚧霉（）。在pH為8.0、培養溫度為28 ℃時，該菌的菌絲生長最快；其生長的最佳碳、氮源及用量分別為8%乳糖和6%酵母浸粉。

銀耳；污染菌；鑒定；絲枝蠟蚧霉；分子特性；生長條件

銀耳（）又名白木耳、雪耳等，有“菌中之冠”的美稱。其美味可口，營養豐富，又具有抗癌等藥用價值，在市場上非常受歡迎。但銀耳在栽培中，容易受到雜菌污染，導致減產或栽培失敗，其中真菌作為主要病害菌是研究的熱點。

經典的微生物分離鑒定方法，主要運用選擇性培養基，在適宜的培養條件下進行培養，進而進行分離純化，而后根據菌體在培養基上生長的形態學特征等作出分類。蘇春麗等認為僅依靠經典分類學方法來對未知病原菌進行細致分類和準確鑒定，存在很多難以攻克的壁壘和嚴重的不足[1]。隨著分子生物學的發展，White等在總結前人研究的基礎上，開拓性地為真菌的rRNA基因核糖體內轉錄間隔區設計了3對特異引物，命名為ITS 1、ITS 4、ITS 5。這3對特異性引物，對于絕大多數的擔子菌和子囊菌都表現出了較為良好的可擴增特性，這為ITS引物的特異性設計，及其成功運用于真菌鑒定奠定了重要基礎[2]。

本研究對銀耳子實體表面發現的一種產紅色色素的污染真菌進行了形態學和分子生物學鑒定，研究溫度、培養基pH、碳源及氮源對該菌株的影響，為今后該菌的防治或應用提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

（1）供試菌株。由福建農林大學菌物研究中心從被污染的銀耳上分離獲得，命名為FQ-01。

（2）供試試劑。PDA培養基：瓊脂粉20 g，葡萄糖20 g，馬鈴薯浸粉5 g，氯霉素0.1 g，蒸餾水1 L；121 ℃高壓滅菌15 min，制成平板培養基待用。PDB液體培養基：葡萄糖20 g，馬鈴薯浸粉5 g，氯霉素0.1 g，蒸餾水1 L；121 ℃高壓滅菌15 min，待用。

1.2 菌株的形態學觀察和鑒定

（1）銀耳污染菌（FQ-01）的分離。從患病的子實體（圖1）上用滅過菌的接種針鉤取病原菌的尖端菌絲，移入PDA平板，28 ℃恒溫培養。再從無污染的培養皿上用滅過菌的接種針鉤取前端菌絲，移入新鮮的PDA試管，28 ℃恒溫培養。

圖1 患病的銀耳子實體

（2）形態觀察。將污染菌接種至PDA平板上，28 ℃培養3～5天后，觀察菌落形態。隨后從培養的菌落上切取一小塊菌塊，轉接到新的PDA平板上，接近接種塊2～3 mm處，斜插入一塊無菌的蓋玻片，待菌絲爬上蓋玻片后，取出在電子顯微鏡下觀察：菌絲生長形態，分生孢子梗形態，分生孢子形態及大小等。測定孢子的長度和寬度，根據菌落特征形態、孢子特征，對FQ-01菌進行初步形態學鑒定[3, 4]。

（3）分子生物學鑒定。將接種至PDA平板上，28 ℃培養3～5天的菌株，用直徑9 mm 的打孔器在菌落邊緣切取菌塊。接種于PDB培養基中，置于28 ℃的振蕩培養箱中，150 r/min振蕩培養120 h。之后用濾紙過濾，使用無菌蒸餾水沖洗7～8次，并置于無菌濾紙上吸干后待用。

菌絲體使用Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒提取基因組DNA。ITS-r DNA序列擴增采用真菌通用PCR 擴增引物[5]：ITS1-F：5’-CTT GGTCAT TTA GAG GAA GT-3’ ITS4-R：5’-CCT CCGCTT ATT GAT ATG C-3’ 。PCR反應體系（50 μL）為：基因組DNA（200 ng/μL）2.0 μL，引物ITS1（20 μM）1.0 μL，引物ITS4（20 μM）1.0 μL，2×Taq PCR Master Mix 25.0 μL，ddH2O 21.0；反應條件：94 ℃預變性3 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，32個循環，72 ℃延伸10 min。

電泳結束后將瓊脂糖凝膠轉移至溴化乙錠溶液（1 mg/L）中，浸沒染色20 min，再用清水漂洗2 min后將凝膠轉移至凝膠成像系統，開啟紫外觀察，并拍照記錄電泳結果。回收的PCR產物交由生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，將測序在GenBank進行同源性比對，并在NCBI-Blast中選擇重合率較高的菌株，再運用MEGA 6.0軟件構建FQ-01菌的系統發育樹。

1.3 碳源利用實驗

以PDA培養基為基礎培養基。以乳糖、蔗糖、甘油、可溶性淀粉等量替換基礎培養基中的葡萄糖。進行最佳碳源及最佳添加比例實驗，添加質量百分比分別為6%、8%、10%、12%。使用內徑為9 mm的打孔器，在已經過活化培養3天的菌株供試平板菌落的同一半徑處打孔取出菌塊，接種到供試平板培養基上，置于28 ℃下正置培養，培養至第三天后開始采用直尺十字交叉法測量菌落的生長直徑。每隔2天觀測一次，直到第11天。

1.4 氮源利用實驗

以PDA培養基為基礎培養基。以蛋白胨、硝酸鉀、硫酸銨、尿素和酵母浸粉等量加入基礎培養基，進行最佳氮源及最佳添加量實驗，添加質量百分比分別為6%、8%、10%、12%，其余操作同碳源實驗。

1.5 最適生長溫度實驗

將菌塊分別接種于新的PDA平板上，分別置于20 ℃、25 ℃、28 ℃、30 ℃、36 ℃五個不同溫度的生化培養箱內正置培養。其余操作同碳源實驗。

1.6 最適pH實驗

將滅菌后的PDA培養基pH分別調至4.0、5.0、6.0、7.0、8.0后傾注平板，冷卻后接種菌株，置于28 ℃下正置培養。其余操作同碳源實驗。

2 結果與分析

2.1 菌落形態特征

于28 ℃培養9天時，PDA培養基上的菌落形態特征為：菌絲呈白色絮狀，菌絲體生長較為致密（圖2-A），在PDA培養皿上，菌落背面呈現紅色或深紅色，色素常常擴散到整個瓊脂培養基內（圖2-B），平均生長速度為4.69 mm/d。

圖2 經分離純化的銀耳污染菌（FQ-01）

2.2 顯微觀察形態特征

電鏡下觀察，FQ-01菌的孢子梗細胞呈花瓶狀，多為對生，瓶梗頂端形成卵圓形或橢圓形分生孢子，大小約為1.8 μm×2.0 μm（圖3），且FQ-01菌的菌絲可以侵入銀耳子實體內（圖4）。

2.3 分子生物學鑒定結果

以提取的FQ-01菌的DNA為模板進行ITS擴增，擴增出的片段結果如圖5所示，在分子量600 bp左右得到一條清晰的條帶。

分別將測序得到的FQ-01菌ITS序列，利用BLAST軟件（Basic Local Aligment Search Tool，Ver2126）與GenBank數據庫的已知序列進行同源性比對。軟件構建該菌株的系統發育樹如圖6所示，FQ-01菌與strain Z06的系統發育關系最為親密，ITS序列的同源性達到99%。

圖3 FQ-01菌孢子及孢子梗形態（A：3000×；B：9000×）

A：正常銀耳，1000×；B：染菌銀耳，2000×。

根據相關文獻對絲枝蠟蚧霉（）的主要屬的特征描述[5]：分生孢子梗通常著生于氣生菌絲上，其一至幾個瓶狀小梗輪生至對生。這與本文顯微觀察的生物學特征一致，結合生物學和分子學特征，確定污染菌為絲枝蠟蚧霉（）。

2.4 培養特性

（1）碳源。實驗結果（圖7）顯示，FQ-01菌在乳糖培養基上生長速度較快，其次是蔗糖、可溶性淀粉、葡萄糖培養基，為甘油時生長較慢。

不同乳糖濃度培養，FQ-01菌在8%乳糖培養基上生長速度最快，以下依次是6%乳糖、12%乳糖和10%乳糖（圖8）。

（2）氮源。實驗結果（圖9）顯示，FQ-01菌在酵母浸粉培養基上生長最快，其次是硝酸鉀培養基、蛋白胨培養基、硫酸銨培養基、尿素培養基，均優于未額外添加氮源的對照PDA培養基。

圖5 FQ-01菌 ITS序列擴增產物瓊脂糖凝膠電泳圖

圖6 FQ-01菌 ITS系統發育樹

圖7 不同碳源培養基FQ-01菌的生長速度

在相同乳糖濃度培養下，FQ-01菌在6%酵母浸粉培養基上生長最快，其次是8%酵母浸粉培養基、12%酵母浸粉培養基、10%酵母浸粉培養基（圖10）。

（3）溫度。實驗結果顯示，FQ-01菌菌絲除在36 ℃下停止生長外，其他溫度均可生長。28 ℃時菌落生長較快，為2.13 mm/d；其次是25 ℃（圖11）。

（4）pH。實驗結果顯示，pH為8時菌絲生長速度較快，為2.46 mm/d；其次為pH 7、6、5，均優于pH 4的生長速度（圖12）。

3 結果與討論

本研究對一株產紅色素銀耳污染菌進行分離，參考李永紅的研究方法，對該菌進行生物學分類和分子學分類鑒定[6]。

污染菌在電鏡下的菌株形態呈現分生孢子著生于單個孢子梗上，孢子呈橢圓形，孢子梗呈花瓶狀，梗頂端著生卵圓形或橢圓形分生孢子，產生紅色色素，與絲枝蠟蚧霉的特征相似。通過ITS測序進行基因序列比對，與絲枝蠟蚧霉的相似性為99%。綜合生物學特征和分子學特征，鑒定該菌為絲枝蠟蚧霉（Lecanicillium aphanocladii）。該菌在以乳糖、酵母浸粉為碳、氮源，pH為8的培養基上，28 ℃培養時菌絲生長速度較快，乳糖、酵母浸粉較適添加量分別為8%和6%。

圖8 不同乳糖含量培養基FQ-01菌的生長速度

圖9 不同氮源培養基FQ-01菌的生長速度

圖10 不同濃度酵母浸粉培養基FQ-01菌的生長速度

圖11 不同溫度FQ-01菌的生長速度

圖12 不同pH培養基FQ-01菌的生長速度

蠟蚧霉屬隸屬于子囊菌門（Ascomycota），肉座菌目（Hypocreales），蟲草菌科（Cordycipitaceae）。國內對該屬的分類研究報道較少，僅見有名錄，未見詳細的分類描述及鑒定。謝占玲等對青海湖耐鹽真菌調查時曾分離到[6]，苘娜娜等從浙江省蠶區的病蠶或病蛹中也曾分離到，和[7]。

真菌能形成化學穩定性高、化學結構及色調多樣的色素。例如能合成和分泌各種醌類、酸類、酮類以及一些含氮化合物色素[8]。目前，已獲得高產色素的主要真菌類群有紅曲霉、青霉、擬青霉和蟲草[9]中的一些種。其中，一些不產毒素的青霉，如產紫青霉（Fleroff）等研究報道較多[10, 11]。Gunasekaran ＆ Poorniammal報道了一個產蒽醌類紅色素的青霉新菌株[12]，此菌產生的色素可用于食品和化妝品，通過優化培養條件，紅色素的產量可提高7倍。本研究鑒定的產紅色素的絲枝蠟蚧霉菌株，可為天然紅色素在食品和化妝品等領域的應用提供新資源。

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[2] White T J, Bruns T, Tee S, et al. Application and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics[A]. In: Innis M A, Gelfand D H, Sninsky J J, et al. PCR Protocols: A Guid to Methods and Applification San Diego[C]. Academic Press Inc, 1990:315-322.

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[12] GUNASEKARANS，POORNIAMMAL r. Optimization of fermentation conditions for red pigment production fromPenicillium sp. under submerged cultivation[J]. African Journal of Biotechnology, 2008, 7(12): 1894-1898.

Isolation and identification of a funguspathogen ofand its growth conditions

Qiu Xibin1, 2

（1. Fujian Inspection and Research Institute for Product Quality, National Center for Quality Supervision and Inspection for Processed Food, Fuzhou 350002, China; 2. Fujian Agriculture and Forestry University, College of Food Science, Fuzhou 350002, China）

A kind of fungus pathogen producing red pigment was found on fruit body surface of. The pathogen was identified by morphological and molecular classification as. The experimental results showed that the mycelial growth speed was the fastest when the pH was 8.0 at 28 ℃. The optimal carbon source and nitrogen source for the strain was 8% lactose and 6% yeast extract powder.

; identifition; molecular characterization; growing conditions

S646

B

2095-0934（2018）04-240-05