羊肚菌子實體發育生物學（上）——生物學和非生物學因子對菌絲培養和子實體形成的影響

趙永昌 柴紅梅 陳衛民 趙子悅 孔令艦

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羊肚菌子實體發育生物學（上）——生物學和非生物學因子對菌絲培養和子實體形成的影響

趙永昌 柴紅梅 陳衛民 趙子悅 孔令艦

（云南省農業科學院生物技術與種質資源研究所，云南 昆明 650221）

指出羊肚菌具有物種多樣性，羊肚菌分類尚存在問題和難點；多方面系統分析羊肚菌生態學，包括環境生態因子（土壤、溫度、濕度、光照、氧氣和二氧化碳）、營養方式（腐生、菌根）和內生或附著生物體（真菌、細菌、病毒、質粒等）；總結羊肚菌發育生物學研究進展，包括子囊孢子形成與萌發，多變的培養形態，菌核形成與變化，分生孢子，原基形成分化與子實體形成，出菇方式與富營養栽培等。

羊肚菌；物種多樣性；生態學；土壤特性；營養方式；發育生物學

羊肚菌營養豐富，含有多種活性和風味物質[1～8]，是世界四大名菌之一。羊肚菌的研究起步較早，除物種學的基本生物學意義之外，早期研究多圍繞栽培技術領域展開，而明確物種和生態環境則是栽培的前提。自1982年Ower首次在室內培養出羊肚菌子實體[9]后，研究的重點集中在菌種的培養特性上。雖然美國兩家公司Terry Farms Inc.（http://articles.sun-sentinel.com/1994-08-29/business/9408260029_1_mushroom -farm- white-button-terry-cos）和Diversified Natural Products，Inc.(http://msutoday.msu.edu/news/2005/biotech -brings-mushroom-hunt- indoors/）實現了羊肚菌的工廠化栽培，但具體的技術細節和理論依據仍不太清楚，且已不再進行生產。

2002年以來，我國實現了圓葉楊基質的羊肚菌大田栽培和基于營養袋技術的羊肚菌大田栽培，有望在不遠的將來種植面積突破10萬畝，總產量進入萬噸級。我國種植業畝效益過萬元的不少，食用菌中平菇是一例，但是其勞動強度較大。表面上看，羊肚菌種植簡單，勞動強度小，預期效益高，各級政府紛紛將其作為精準扶貧和脫貧致富的產業來發展。而事實上羊肚菌種植并不簡單，純種植戶除個別規模小的收益不錯外，整體看并不賺錢，主要原因是產量不穩定。所以，為了羊肚菌產業的健康發展，有必要加強對羊肚菌子實體形成的相關基礎生物學的研究。本文結合我們自己的科研工作對近年羊肚菌發育相關的基礎生物學研究進展和存在的問題進行系統總結和分析。

1 物種多樣性

由于生境對羊肚菌的形態有較大的影響，且形態分類可以用的宏觀、微觀特征較少，羊肚菌的分類一直是難點。目前記錄的種和變種多達334個（www.indexfungorum.org/Names/Names.asp，2018.2.12），多種生物化學和分子生物學的手段已用于羊肚菌的系統分類和物種多樣性的研究上[10～21]，多基因系統學方法將羊肚菌分為黃色、黑色、紅色三大類群，報道的系統學種有68個（黑色38個，黃色28個，紫褐色2個）[22～29]。分子系統學雖然糾正或彌補了羊肚菌分類上的一些錯誤和不足，對一部分系統學種進行了描述，并發現了一些新的物種[30～39]，但仍存在以下問題：（1）還有許多系統學種沒有被正式描述；（2）系統學種與已發表的形態學種之間的對應關系也未完全確定，一些形態學種是否存在未完全確定；（3）同屬之間的物種ITS片段大小差別不大，但羊肚菌三個類群之間的差別較大。產生這些差別的原因不清楚，在系統發育學、分類學上的意義也不明確。分類學上的問題得不到解決，對羊肚菌栽培中的遺傳與育種研究影響較大。

2 羊肚菌生態學

2.1 環境生態因子

雖然羊肚菌特別是黃色類群分布區域比較廣泛，但一般情況下羊肚菌居群數量較小，發生的時間較短，整體生物量不大，這也是其珍稀名貴的重要原因。影響羊肚菌生長發育的環境生態因子包括植被、氣候和土壤，從生物地理學的角度來說，這3個因子相互間密切相關。不少學者對羊肚菌發生的生態環境進行了長期細致的研究[40～48]，得到有益的結果。

2.1.1 土壤

土壤對土生大型真菌的生長發育影響，包括土壤物理化學特性（顆粒度、pH、溶氧能力、持水能力等）、有機無機營養成分（有機質、堿解氮、速效磷、速效鉀、有效硫、鈣、鎂、鐵、鋅、鉬、錳、硼、銅、硅、鈉等）和土壤微生物類群等，一般認為子囊菌發生在中性偏堿性的土壤中，羊肚菌也如此，目前報道的羊肚菌發生區的土壤以pH 6.5～8.5的砂質土壤為主。

（1）pH。在野外調查過程中發現羊肚菌子實體根部1 cm處的pH比10 cm處低0.1～0.3，森林大火之后土壤的pH會上升，pH上升刺激了包括羊肚菌在內的大量子囊菌發生，而這些菌類的發生又促進了土壤的修復與恢復，有利于植物的生長。但是，大田栽培的結果表明，羊肚菌特別是黑色類群對土壤的pH無嚴格要求，pH 5.0～8.8都能成功栽培出菇。

（2）礦質元素。研究表明，礦質元素影響羊肚菌的菌絲生長速度和菌核形成，栽培中施加微肥還對土壤中微生物群落產生影響，進而影響到栽培的產量和子實體中微量元素、氨基酸的含量[49～51]。趙永昌等對羊肚菌3個產地的土壤進行分析，所測得的各元素含量均在生物生長的臨界值以上，而磷、鉀、鐵、鋅、銅、錳、硼和鉬則均高出臨界值許多，特別是磷、鉀和鋅，表明羊肚菌對磷、鉀和鋅有富集作用，而土壤富含有效磷、鉀、鋅是羊肚菌發生的必要條件[48]。另一特點是，羊肚菌的發生地，鐵與鎂、鋅、銅、錳形成補充和拮抗關系，即鎂、鋅、銅、錳含量高時，鐵含量低；反之亦然。這也許是羊肚菌發生的特定環境要求。羊肚菌發生區土壤微量元素背景值中，錳、銅、鋅、鉛、鎳等元素的全量分布背景值明顯高于非羊肚菌發生區。在氣候條件適宜的情況下，羊肚菌的產量似與這些元素的全量分布背景值成正相關。

（3）土壤微生物。雖然有研究表明一些種類的真菌和細菌是大型真菌生長發育的助手，但羊肚菌發生區域土壤結構、營養狀態差別較大，微生物群落結構更是千差萬別。趙永昌等研究指出，羊肚菌發生區細菌及放線菌數量較多但差別小，酵母菌差別較大，而絲狀真菌則有鐮刀菌屬（）、青霉屬（）、曲霉屬（）、根霉屬（）、毛霉屬（）等20余種[48]。這些真菌多數為腐生真菌，分解纖維素、木質素等。羊肚菌與微生物之間似沒有特定的關系。大田栽培試驗表明，未栽培羊肚菌的土壤真菌多樣性指數和豐度顯著大于羊肚菌根際土，染病羊肚菌根際真菌豐度和多樣性大于正常生長的羊肚菌，各樣品的群落組成和優勢類群有較大差異[52]。圓葉楊栽培點土壤和非栽培點土壤微生物多樣性研究發現土壤真菌12種，栽培點和非栽培點在優勢真菌種群上有一定的區別，其中盤菌綱真菌群落存在很大的差異；羊肚菌出菇土壤的真菌豐度低于對照，可能與土壤中羊肚菌優勢種群對其他種群的抑制作用有關；土壤中細菌包括擬桿菌門、放線菌門、厚壁菌門和變形菌門細菌15種，土壤中細菌的優勢種群與是否栽培羊肚菌并無很大關系，栽培土樣的優勢種群基材目同[53～55]。Singh等研究發現羊肚菌發生區的優勢真菌有,sp.，，，和，優勢細菌為，，和spp.，出菇點與非出菇點的差別明顯[56]。真菌和細菌的相互作用是土壤微生物生態的重要組成部分，目前對羊肚菌與細菌之間的作用研究較少，研究發現可作為細菌的農夫（a bacterial farmer），包括羊肚菌通過生長協助細菌擴散（bacterial dispersal），羊肚菌的分泌物飼喂細菌，幫助細菌進行碳源的收獲和轉移，同時羊肚菌也是相互作用的受益者，即獲取碳源和增加抗性[57]。

（4）大火對土壤特性和羊肚菌發生的影響。雖然世界范圍內的采菇者都知道火災后會產生大量羊肚菌，但很少有人進行定量的研究。Larson等對火災后Sierra Nevada地區羊肚菌的豐富度進行評估[58]，調查了該區域羊肚菌的時空變化。不同的真菌對火燒強度的反應差別較大，中高強度的火災后羊肚菌等子囊菌增加100倍以上，這些菌的產生對生態恢復有益[59]。雖然人們也能在沒有受到干擾的林地找到羊肚菌，但是在受到火災、蟲害影響而死亡的林地或土壤受到干擾的林地更容易找到。有些管理者使用疏林、燒山的方法增加羊肚菌產出量，這種干擾具有盲目性，而對羊肚菌的多樣性、生態等進行深入的研究則較為困難[60]。羊肚菌有時表現出較好的耐溫特性，遭受過一定大火的森林土壤會瘋長，人們對這一過程中控制子實體發生的生態習性知之甚少。有人觀察森林大火后下一季節黑色羊肚菌的生長，采取清理火燒點的樹樁、用重型機械壓實火燒地土壤并覆蓋有羊肚菌發生地木屑的新土等處理，子實體增加較多，而未處理的火燒地只有少量子實體，同一地點未受大火影響的沒有發生子實體[61]。通過分析收集的生態信息、遺傳數據以及收購者信息發現，火燒后針葉樹周邊有5種類型的羊肚菌，以灰色羊肚菌較多，而且采菇者確認灰色羊肚菌商業價值高，因為其個大體重，耐儲存[62]。

2.1.2 溫度

羊肚菌不同種或同種的不同菌株對溫度的適應性有差別，室內培養表明，羊肚菌在2～35 ℃都能生長，但形態特征和活力差別較大。目前關于溫度對羊肚菌生長發育的影響值得注意的是：（1）耐低溫特性。羊肚菌低溫耐受性還沒有較好的研究，如在新疆伊犁、陜西榆林地區種植后要經過寒冷的冬天，一般溫度低于－20 ℃，凍土層在20厘米以上，春季溫度回升后羊肚菌即快速出菇。這樣的環境條件，凍土層內是否有存活的羊肚菌菌絲體？若有，羊肚菌抗凍的機制是什么？若沒有，羊肚菌菌絲體在凍土層形成之前如何靠低氧生長進入非凍土層？（2）耐高溫特性。森林大火后的下一季節羊肚菌會大量產生（指春季森林大火后秋季產生，或秋季森林大火后春季產生），火燒地上產生的羊肚菌種源來自何方？雖然Li等研究了不同火燒方式對梯棱羊肚菌種植的影響，認為表面過火可促進羊肚菌生長，增加產量，但這與野生狀態過火后大量產生羊肚菌不同，這只是純粹的改變土壤性質[63]。羊肚菌種植后進行火燒對羊肚菌的影響目前尚無研究，一般的研究者認為羊肚菌種源可能來自空氣。若種源真是來自空氣，則說明空氣中羊肚菌孢子的密度比較高，應該可以監測到，但沒有相應的研究結果；若不是，說明羊肚菌能耐受短時間的高溫，耐高溫的生物學機制是什么？（3）我們利用溫濕度記錄儀對不同梯棱羊肚菌、六妹羊肚菌菌株的生長發育溫度（1米處空氣溫度、地表空氣溫度、土壤10厘米處溫度）進行了監測，不同種菌株和同種不同菌株之間存在一定的差別（表1），但不同年份之間也有差別，說明溫度對羊肚菌子實體生長發育的影響是多方面的，包括最高溫、最低溫、積溫、溫差及同期的濕度等，準確的作用需在可控溫的條件下進行研究。

影響羊肚菌生長發育的因素包括生物的和非生物的，而人們對這些因子的了解和認知有限，只有通過持續的研究和觀察才能掌握。羊肚菌子實體形成對應于春季土壤和空氣溫度的轉換，而產量與出菇前30天的降雨量密切相關。野生羊肚菌采收期極短（6～7天），出菇期長短與土壤溫度關系密切，即只有一個比較窄的出菇土壤溫度范圍[64]。一般認為黃色和褐色類群屬于耐溫型，發生周期較長，在以色列從冬季到春季（11月至次年5月）都有發生。有些地區氣候適宜，一些品種出菇期也較長，從早春出到中秋[65]，這類種質材料值得研究。調查發現，羊肚菌子實體的發生對應的是土壤逐漸變干[66]。雖然一般情況下羊肚菌以春季出菇為主，但研究表明夏季羊肚菌菌絲體會在土壤中迅速擴張并形成一些特殊的結構儲存營養以備下年春季出菇[67]。

2.1.3 濕度

水分是影響食用菌子實體生長發育的重要因子，包括基質含水量和空氣濕度。羊肚菌生長發育需要的空氣濕度與大多數食用菌基本相同，即80%～95%（表2）。有研究表明，羊肚菌栽培過程中需要重水刺激原基形成[9，68～70]，但是自從使用了覆膜技術，這一理論又受到質疑。一方面使用覆膜技術減少了用水，保濕效果較好，另一方面若出菇前不揭膜可以免去重水催菇。羊肚菌對生長基質水分的需求與多數食用菌不同，其栽培后若水分少則易發生生理病害導致死菇，水分多又易發生病原病害。由于不同種類土壤的持水能力不同，影響水分蒸發量的因素又較多，因此對水分管理要求較高，有必要對羊肚菌生長發育的水分需求進行深入研究。

表1 羊肚菌發育相關溫度（℃）

表2 羊肚菌發育相關水分條件

2.1.4 光照

雖然不同種類食用菌原基形成和分化對光照的需求差別較大，但總體上都需要散射光。一般認為羊肚菌喜陰耐濕，光照對羊肚菌生長發育影響的研究較少。有研究表明，羊肚菌菌核的形成與光照時間和強度成反比[71]。目前羊肚菌子實體原基形成有兩種形式，一是菌絲在地表聚集逐步發育形成原基，再分化成幼菇[9, 69, 70]；二是在地表下形成原基，長出地表時是幼菇，由于無法定位出菇點，這種情況尚沒有報道。多數研究認為，散射光對羊肚菌原基形成和分化有促進作用，強光容易導致幼菇死亡和成菇禿頂。然而，黑白膜大棚、黑白地膜、雙層遮陽網的使用結果表明，散射光對原基形成和分化不是必需，光照主要影響菇體的生長速度和顏色，光照弱時子實體顏色淺、成熟期長（圖1）。

2.1.5 氧氣與二氧化碳

一般認為羊肚菌生長發育消耗氧氣，產生二氧化碳，高濃度的二氧化碳可能導致蓋小柄長。但二氧化碳和氧氣對菌絲生長、菌核形成、分生孢子產生、原基形成和分化的影響研究較少，主要原因還是不可控條件下羊肚菌的生長發育階段的重復性較差。羊肚菌采取農作物種植的覆膜保水技術，在覆膜條件下羊肚菌生長發育階段的特點也發生了較大的變化，如分生孢子產生的時間和數量與不覆膜有明顯差別，且在覆膜狀態下即可產生原基并分化。覆膜與不覆膜在保濕、氧氣和二氧化碳濃度上也是有較大差別的，覆膜技術有利于羊肚菌的生長發育，除保濕外，是否與氧氣和二氧化碳濃度有關，值得深入研究。

圖1 光照對子實體顏色的影響

2.2 營養方式

羊肚菌營養方式的研究起步比較早，早期多數真菌研究者認為羊肚菌是菌根菌，原因是羊肚菌在實驗室較難培養出菇，且與特定的樹種（榆樹、蘋果樹、楊樹等）密切相關[72～75]，而在野外還發現有的品種與植物形成特殊的結構[76]。不可否認的是羊肚菌確實具有較強的腐生能力，能在死亡的樹木上快速生長，同時相關的酶學研究也表明其具有分解木質素、纖維素的胞外酶。目前，梯棱羊肚菌、六妹羊肚菌、七妹羊肚菌等實現了人工栽培，多數學者認為羊肚菌可能是兼性的，即同時具有腐生和菌根特性。無論是腐生還是菌根目前都有研究和相關的證據，多數證據顯示黑色類群菌根多，黃色類群腐生多。但由于生態的差異即使是同一物種，在不同生態下營養方式也有可能不同。

目前，羊肚菌多數種與特定的植物有關系，但沒有得到較好的解釋，普遍認為多數種與植物的關系是腐生或內生，少數種是純腐生。羊肚菌發生地主要為相對潮濕的林下和草地，黃色類群主要生長在落葉樹下，黑色類群多數生長在針葉樹林地或火燒地，而在云南滇西北地區種過中藥而荒廢的純草地上也大量出現梯棱羊肚菌。雖然大多數羊肚菌發生在春季，但也有種類只發生在秋冬季。與羊肚菌發生相關的菌根植物種類也是有差異的，且隨地理氣候的不同差別較大，如同一種羊肚菌在歐洲、美洲和亞洲都有分布。

2.2.1 腐生

羊肚菌營腐生的證據包括了人工栽培、同位素標記及羊肚菌產生各種木質素、纖維素分解酶。不同種類羊肚菌均可產生高活性的漆酶和木質纖維素酶、Mn氧化酶、纖維素酶、淀粉酶、蛋白酶、愈創木酚酶、漆酶等[77～81]。不同類群、不同種和同種不同菌株在產酶活力上有差異，相比黑色類群，黃色類群產生cellulase，amylase，pectinase and urease的活性較高，通過這些酶的活性可以區別是黃色還是黑色類群[82, 83]。不僅不同物種的產酶活力不同，即使是同一子實體的不同單孢，同一菌株的不同發育階段也有差別。不產菌核菌株的蛋白酶、過氧化氫酶和木聚糖酶的平均活性高于產菌核菌株，而漆酶活性卻低于產菌核菌株[84]。除產生與木質素、纖維素降解相關的酶外，羊肚菌還產生與其他碳代謝相關的酶類[85～88]。

對羊肚菌的營養特性研究，不僅局限于傳統的生化分析，同位素標記研究表明盤菌目中的真菌Helvellaceae和Tuberaceae是菌根菌，而Discinaceae和Morchellaceae則是腐生菌[89]，Hobbie等確認火災后產生的羊肚菌是腐生類型[90]，因為木質素降解可產生自發熒光，而研究表明羊肚菌子實體可產生自發熒光[91]。

雖然Kellner等從基因水平上鑒定了羊肚菌種的漆酶基因功能和結構多樣性，分類得到15株羊肚菌的漆酶基因，每個菌株都有1種以上的漆酶，并對漆酶的活性進行了研究[92]。但這種研究還不夠，其未涉及基因調控和表達水平。相信隨著羊肚菌基因組測序完成及各種組學的發展，其腐生特性會得到更深入研究。

2.2.2 菌根

在盤菌類大型真菌中有關于羊肚菌菌根關系的研究[93]，在野外也觀察到羊肚菌與多種植物形成菌根關系[94～98]，在成熟的根部形成菌核，而在小根處形成菌根。室內研究表明，營養、物理及生物因子對羊肚菌與挪威云杉（）的菌根形成具有影響，同時羊肚菌菌絲體與一種細菌一起接種在根部時有助于菌根的形成[99]。羊肚菌除與木本植物形成菌根關系外，與禾本科植物也形成類似的關系。研究表明sp.20能與甜玉米形成外生菌根狀結構（ectendomycorrhiza-like structures），同時能產生植物激素脫落酸（Abscisic acid）、吲哚乙酸（Indole-3-acetic acid）和水楊酸（Salicylic acid），這有益于植物生長和增加抗性[100]。

2.3 內生或附著生物體

開放式生長的大型真菌子實體含有或附著一些其他生物體（真菌、細菌、病毒、質粒等）是比較正常的，這些生物體與大型真菌的關系非常值得研究。其涉及這些生物體是否與大型真菌生長發育相關，是否與食用菌風味物質的產生相關；同時也涉及這些生物體能否產生一些有害物質。Bala等從羊肚菌干品中檢測到18個屬的37種真菌，包括了,a和等屬的多種有害真菌，產生黃曲霉毒素（aflatoxins）、橘霉素（citrinin）、赭曲霉素（ochratoxin）和玉米赤霉醇（zearalenol）[101]。姚麗從羊肚菌子實體中分離得到4種真菌：、、和[55]。沈洪從子實體中檢測到擬桿菌門、變形菌門和厚壁菌門內生細菌7種[54]。何培新等從3個地點的粗柄羊肚菌中分離得到內生真菌14種16株，其中15個菌株為子囊菌或其無性型[102]。

羊肚菌子實體上真菌或細菌可能影響羊肚菌生長發育[103]、風味物質產生[101]及食用安全[101, 104～111]。羊肚菌菌肉較薄，生長過程是內外開放的，從子實體上得到的細菌或真菌是內生還是附著比較難界定。目前還沒有找到與羊肚菌密切相關的細菌或真菌，而從干品上得到的真菌則更難確定，因為采收后整個過程都有可能附著其他真菌。盡管如此，鑒于近年來羊肚菌栽培的真菌病害比較嚴重，有些真菌還可能是寄生性的，真菌、細菌與羊肚菌之間的相互作用應引起重視，進行深入研究。

除真菌、細菌外，在羊肚菌菌種上檢測到染色體外遺傳單元，包括大小各異的質粒，而這些質粒的作用尚不清楚，但明確檢測到轉錄活性[112, 113]，一般質?；虿《径寂c寄主的抗性相關，羊肚菌的病毒和質粒研究進展較緩慢。（待續）

國家食用菌產業技術體系（CARS-20）；國家自然科學基金（31460014）

趙永昌（1964—），研究員，從事大型真菌資源收集評價與馴化研究工作。E-mail：yaasmushroom@aliyun.com。

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2095-0934（2018）04-201-06