高加索人群白癜風多態性位點與中國漢族人群白癜風發病的相關性研究

高 敏，張 敏，鄭曉冬，周伏圣，李 揚

白癜風(vitiligo)是一種局限性或者泛發性的色素減退/脫失性疾病。多數學者認為白癜風是一種復雜疾病，遺傳和環境因素共同作用從而導致白癜風的發生和進一步發展。前期研究[1]通過全基因組關聯分析(genome wide association study, GWAS)的方法在中國漢族人群中發現染色體6q27的一個約200 kb的區域與中國漢族人群白癜風的發病顯著相關，同時通過基因分型的方法檢測了大量可疑的易感單核苷酸多態性(SNP)位點。

國外學者Jin et al[2]在1 514歐美高加索白人白癜風患者和813例與之相匹配的健康對照者中進行了GWAS研究，發現PTPN22、RERE、GZMB、C1QTNF6和UBASH3A這5個基因的多態性位點與白癜風的發病密切相關。為了驗證這些基因是否與中國漢族人群白癜風發病具有相關性，該研究團隊檢索了白種人數據庫，利用國際單體型計劃(HapMap)中的Haploview軟件，篩選了上述5個基因的8個SNP位點進行深入研究，以期探討上述基因與中國漢族人群白癜風發病是否相關。

1 材料與方法

1.1病例資料

1.1.1入選標準 在全國范圍內收集了漢族人群白癜風患者1 977例，其中男993例，女984例；年齡12～64(27.64±14.46)歲。確診標準：所有病例經Wood燈檢測后，由至少兩位副高以上的副主任醫師確診。此外，收集健康對照人群2 024例，其中男1 081例，女943例；年齡14～65(26.20±12.27)歲，要求其親屬無白癜風以及其他自身免疫性或者系統性疾病。本研究符合赫爾辛基宣言原則且經安徽醫科大學倫理委員會批準。每位入選人員抽取靜脈血3～5 ml，置于EDTA-Na2抗凝管，放入-80 ℃冰箱保存。

1.1.2臨床分組及分層分析 按照首次發病年齡劃分：≤20歲稱為早發型白癜風；>20歲稱為晚發型白癜風。按照先證者一、二、三級家屬中有無白癜風患者分為有家族史和無家族史患者兩組。

1.2SNP位點的選擇查閱文獻以及UCSC、NCBI數據庫，結合國際單體型計劃利用Haploview軟件，篩選出位于PTPN22、RERE、GZMB、C1QTNF6和UBASH3A這5個基因上的8個TagSNPs位點進一步研究。

1.3研究方法

1.3.1基因組DNA的提取和標化 參照Qiagen公司的Flexi Gene DNA提取試劑盒說明書提取基因組DNA，紫外分光光度計測其濃度后將其標準化至15～20 ng/μl備用。

1.3.2引物設計 在NCBI數據庫中獲取上述8個SNP位點的序列，利用Assay Designer3.1軟件設計引物。上海生工合成引物后進行稀釋待用。

1.3.3基因分型 PCR擴增獲得DNA片段，經電泳、純化后在Sequenom Massarray iPLEX系統(美國Sequenom公司)上對篩選出的8個SNP位點進行基因型分型。

1.4統計學處理PLINK 1.07軟件進行Hardy-Weinberg(HWE)平衡檢驗和最小等位基因頻率(MAF)計算。采用SPSS 16.0軟件計算優勢比(odds ratio，OR)、95%可信區間(confidence intervals，CI)和P值，組間比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1基因分型PTPN22、RERE、GZMB、C1QTNF6 和UBASH3A基因上的多態性位點rs2476601、rs301819、rs4908760、 rs11121194、rs8192917、rs5756546、rs11203203和rs2839511在1 977例白癜風患者和2 024例健康對照者間無顯著相關性(P>0.05)，見表1。

2.2基因型-表型分析

2.2.1按照早發/晚發型分組 在1 977例白癜風患者中，早發型患者與晚發型患者兩組之間的基因型以及等位基因頻率分布上的差異無統計學意義(P>0.05)。

2.2.2按照有/無家族史分組 207例患者具有家族史，1 764例患者無家族史，6例患者家族史不詳。位于RERE基因上的SNP位點rs4908760的等位基因頻率在有家族史和無家族史患者中差異有統計學意義(P=0.024)，基因型頻率在兩組患者之間差異性有統計學意義(P=0.012)(表2)，但對上述結果進行組間比較校正后，結果顯示差異無統計學意義；位于GZMB基因上的SNP位點rs8192917的基因型頻率在有家族史和無家族史患者之間差異具有統計學意義(P=0.008)，但其等位基因頻率在兩組之間差異無統計學意義(P>0.05)，見表3。

3 討論

白癜風是一種多基因遺傳的復雜性皮膚病，其發病機制未明，但是遺傳因素在其發病機制中的作用得到廣泛認同。近年來，隨著分子生物學技術和高通量測序技術的飛速發展，白癜風的遺傳學研究取得了較大的進展，尤其是國內外學者運用GWAS，發現了許多有意義的白癜風易感基因及位點[3]。 國外學者Spritz 團隊完成了歐美人群白癜風的 GWAS研究，結果顯示尋常型白癜風與某些自身免疫性疾病相關聯的基因具有相關性，如本研究中的GZMB、RERE、PTPN22、UBASH3A和C1QTNF6基因。

表1 8個SNPs位點的等位基因頻率在病例和對照組間的比較

表2 在有無家族史患者中rs4908760的基因型和等位基因分布

表3 在有無家族史患者中rs8192917的基因型和等位基因分布

PTPN22基因編碼蛋白絡氨酸磷酸酶家族非受體4型亞科。研究[4]顯示該基因的多態性與類風濕性關節炎和系統性紅斑狼瘡等自身免疫性疾病明顯相關。Jin et al[2]研究發現其SNP 位點 rs2476601與歐美人群白癜風發病具有相關性。UBASH3A基因編碼T細胞泛素配體家族，可以負向調節T細胞信號，與糖尿病的發病密切相關，其SNP位點rs11203203和rs2839511與歐美人群白癜風發病相關[5]。C1QTNF6基因是C1q和腫瘤壞死因子相關蛋白6，與中國漢族人群Graves’病的發生具有相關性，該基因的多態性位點rs5756546與歐美人群白癜風發病相關[6]。但是本研究中并未顯示上述三個基因的多態性位點與中國漢族人群白癜風發病具有相關性。

RERE基因位于染色體1q36.23區域，該基因編碼精氨酸谷氨酸的酸二肽重復蛋白質，其超表達可以誘發細胞凋亡，有研究[7]表明其與神經系統發育異常有關。Jin et al[2]研究發現RERE基因上的SNP位點rs1121194、rs4908760和rs301819與高加索人群白癜風的發病有關。本研究顯示該基因上的SNP位點rs4908760的等位基因頻率在有家族史和無家族史患者中差異有統計學意義(P=0.024)，基因型頻率在兩組之間也具有差異性，但是經過校正后，差異并無統計學意義。

GZMB基因又稱顆粒酶 B，能夠被細胞毒性 T 細胞和 NK 細胞識別，從而溶解特定的靶細胞，在細胞介導的免疫反應中發揮作用，有研究[8]表明該基因與類風濕性關節炎的發生具有相關性。國外學者發現其SNP位點rs8121917與歐美高加索人群白癜風發病有關[2]。本研究顯示該SNP位點的基因型頻率在有無家族史患者中存在差異(P=0.008)，但等位基因頻率在兩組患者之間無差異。

本研究并未顯示上述8個SNP位點與中國漢族人群白癜風的發病明顯相關，其原因考慮如下：① 遺傳異質性：歐美高加索白種人群與中國漢族黃種人群在白癜風的遺傳學發病機制中具有明顯的遺傳異質性，其特有的易感基因位點不是中國漢族人群白癜風的易感基因位點；② SNP 位點存在異質性：因為不同種人群的TagSNPs可能不同，并且TagSNPs無法覆蓋整個基因，故而會導致中國漢族人群中的實驗結果與歐美人群存在差異；③ 樣本量可能不足：本研究顯示某些致病SNP 位點對疾病的效力可能比較微弱，故而不一定能夠被檢測出，因此，以后可以通過進一步加大樣本量以及提高SNP的密度來驗證這些易感位點與中國漢族人白癜風發病的相關性。

該研究雖未能在中國漢族人群中成功驗證RERE、PTPN22、GZMB、UBASH3A和C1QTNF6基因的多態性位點與白癜風的相關性，但并不表明這5個基因在漢族人白癜風發病中不起作用，如有可能，將來可通過全基因測序的方法來真正發現這些基因與漢族人群白癜風發病的關聯。此外，由于白癜風發病復雜，環境因素在其發病中也起了至關重要的作用，將來可以通過其他手段，如蛋白質芯片、表達譜芯片和甲基化芯片從多方面來發現白癜風發病的病因，從而為早期診斷、干預和治療奠定基礎。