5,7,3’-三乙酰橙皮素對博來霉素致大鼠肺纖維化的影響及作用機制

謝小麗，李 俊

肺纖維化(pulmonary fibrosis，PF)是一種致死率極高的組織結構破壞性肺疾病。其病程包括肺泡上皮細胞損傷、異常增生、炎性細胞積聚，成纖維細胞增生，細胞外基質沉積及瘢痕組織形成。因其死亡率高于大多數腫瘤，平均診斷生存期僅2.8年[1]，是典型的“類腫瘤疾病”[2]。美國胸科學會和歐洲呼吸學會推薦的聯合治療包括皮質激素和硫唑嘌呤或環磷酰胺，但目前臨床缺乏足夠療效證據。5,7,3’-三乙酰橙皮素(5,7,3'-triacetyl hesperidin，TAHP)為橙皮苷的結構衍生物，研究[3]顯示其具有改善微循環、抗炎免疫、抗氧化等多重功效。該實驗采用博來霉素誘導大鼠肺纖維化，觀察TAHP對模型大鼠的治療作用并探索其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 清潔級SD大鼠120只，雄性，體質量(200±20)g，由安徽醫科大學實驗動物中心提供。

1.1.2藥品與試劑 博來霉素(bleomycin A5, BLM)購自哈爾濱博萊制藥有限公司，批號：1108422，以生理鹽水配成1 g/L溶液；TAHP由橙皮苷(云南藥物研究所提供)合成并純化，純度>90%；醋酸地塞米松(dexamethasone, DXM)片購自浙江仙琚制藥股份有限公司，批號：1109110；羥脯氨酸(hydroxyproline，HYP)試劑盒購自南京建成生物工程研究所；丙二醛(malondialdehyde，MDA)、谷胱甘肽(glutathione，GSH)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)ELISA試劑盒購自美國R&D公司；PCR試劑盒購自美國Thermo Scientific公司；引物由上海生工生物工程公司合成。

1.1.3儀器 uQuant全波長酶標儀購自美國Biotek公司；DL-5000B低速冷凍離心機購自上海安亭公司；高速冷凍離心機、Mastercycler. Ep型梯度PCR儀購自德國Eppendorf公司；Power-Pac HC型電泳儀購自美國伯樂公司；GSG2000Ⅱ型凝膠成像系統購自珠海黑馬公司。

1.2方法

1.2.1動物分組 大鼠常規適應性飼養1周后，隨機分為6組：對照組、模型組、TAHP組(50、100、200 mg/kg)及陽性藥DXM 組(1.4 mg/kg)。

1.2.2模型建立 除對照組外，其余各組氣管內一次性滴注博來霉素(5 mg/kg)復制大鼠肺纖維化模型，對照組用生理鹽水代替。造模后第2天開始灌胃給藥，每日一次，對照組和模型組給予等體積的0.5%羧甲基纖維素鈉溶液。

1.2.3樣本采集 造模后7、14、28 d大鼠分批麻醉后放血處死，分離肺組織，右肺經氣管灌注10%中性甲醛后投入固定液固定用于病理學檢測，左肺凍存于-80 ℃冰箱，待測生化指標。

1.2.4組織病理學觀察 每組隨機取6只大鼠肺組織固定24 h后，按常規制作蠟塊、切片后進行HE染色和Masson染色。分別對7、14、28 d肺組織的肺泡炎、肺纖維化程度和膠原蛋白情況進行觀察、分析。

1.2.5組織相關生化指標檢測 按照相應ELISA試劑盒操作步驟檢測組織中HYP、MDA、GSH及SOD的含量。

1.2.6TAHP對肺纖維化大鼠相關基因表達的影響 RT-PCR檢測轉化生長因子-β1(transforming growth factor beta 1，TGF-β1)、平滑肌肌動蛋白α(alpha-smooth muscle actin，α-SMA)、干細胞因子(stem cell factor，SCF)及干細胞因子受體(c-Kit receptor，c-Kit) mRNA的表達。PCR引物設計見表1，PCR擴增條件見表2。

表1 PCR引物和擴增長度

2 結果

表2 PCR反應條件

2.1肺組織病理觀察變HE、Masson染色結果顯示：各對照組肺組織結構清晰，肺泡上皮細胞結構完整，肺泡壁未見增厚，間質未見膠原沉積。模型組肺泡炎和肺纖維化現象明顯，大量中性粒細胞、巨噬細胞和淋巴細胞向肺泡腔和肺間質浸潤，肺間質內成纖維細胞積聚、肺泡間隔增寬，出現膠原沉積。且隨著時間的推移、肺內膠原沉積逐漸加重，病變呈現從肺泡炎向纖維化轉化趨勢。DXM組的肺泡炎和肺纖維化程度較模型組減輕。TAHP各劑量組大鼠肺組織的炎性細胞浸潤區域、成纖維細胞聚集程度和細胞外膠原沉積面積均較同時期模型組有所減小，且肺組織結構相對完整，顯示肺泡炎程度和肺纖維化程度較模型組有不同程度的降低，高劑量TAHP組(200 mg/kg)控制炎癥細胞浸潤及肺纖維化程度與DXM組相當。結果見圖1～3。

2.2TAHP對肺纖維化大鼠肺組織中MDA、SOD、GSH和HYP含量的影響與對照組比較，模型組大鼠肺組織中HYP和MDA含量顯著升高(P<0.05)，GSH和SOD含量顯著降低(P<0.05)；TAHP各劑量組大鼠肺組織中HYP和MDA含量較模型組有不同程度的降低(P<0.05)，GSH和SOD含量較模型組均有提升(P<0.05)，但未呈現明顯劑量相關性，結果見圖4。

2.3TAHP對肺纖維化大鼠相關基因表達的影響與對照組比較，模型組大鼠肺組織中TGF-β1、α-SMA、SCF和c-Kit mRNA表達升高(P<0.05)；與模型組比較，TAHP中、高劑量給藥組(100、200 mg/kg)均能下調肺纖維化大鼠肺組織中TGF-β1、α-SMA、SCF和c-Kit的表達水平(P<0.05)。而TAHP低劑量給藥組(50 mg/kg)對大鼠肺組織TGF-β1、α-SMA、SCF和c-Kit的表達水平無顯著改變。結果見圖5。

圖1 TAHP治療7 d后各組大鼠肺組織染色 ×200

A：對照組；B：模型組；C：TAHP 50 mg/kg；D：TAHP 100 mg/kg；E：TAHP 200 mg/kg；F：DXM 1.4 mg/kg；1：HE染色；2：Masson染色

3 討論

目前模仿人類肺纖維化病理特點、動物造模的最常用技術是氣管內滴注博來霉素復制肺纖維化模型。本實驗模型組大鼠肺組織中有大量炎癥細胞浸潤、膠原聚積、纖維組織增生明顯，肺泡間隔不規律性增寬、部分肺泡結構破壞、甚至消失，基本符合肺纖維化的解剖學特點，且反映膠原代謝的HYP含量明顯升高說明大鼠肺纖維化模型制備成功。5,7,3’-三乙酰橙皮素能明顯減輕肺纖維化大鼠的肺泡炎和肺纖維化程度、降低肺組織HYP含量等，說明5,7,3’-三乙酰橙皮素對于博來霉素誘導的大鼠肺纖維化有一定治療作用。

圖2 TAHP治療14 d后各組大鼠肺組織染色 ×200

A：對照組；B：模型組；C：TAHP 50 mg/kg；D：TAHP 100 mg/kg；E：TAHP 200 mg/kg；F：DXM 1.4 mg/kg；1：HE染色；2：Masson染色

脂質過氧化是肺纖維化病程中關鍵的致病因素[4]。本實驗中關于肺纖維化過氧化涉及的相關指標包括：SOD作為超氧陰離子自由基的中和劑，可維持機體的氧化與抗氧化平衡，對自由基啟動的過氧化反應有較強的抑制作用。測定SOD可判斷與評價機體自由基損傷程度與自由基清除劑藥物的治療效果。GSH作為一種重要的抗氧化劑，在谷胱甘肽過氧化酶催化下，其巰基能將細胞產生的H2O2還原成H2O，且在人類纖維化疾病和動物纖維化模型中，GSH含量明顯降低，該值是衡量纖維化疾病程度的重要參數。MDA是脂質過氧化的最終產物，由機體內氧自由基攻擊細胞膜的不飽和脂肪酸產生，該值反映組織過氧化損傷的程度。結果顯示：在給予 5,7,3’-三乙酰橙皮素治療后，肺纖維化大鼠組織中的MDA和HYP含量均有不同程度的降低，表明 5,7,3’-三乙酰橙皮素降低了肺纖維化大鼠的氧化損傷程度和膠原蛋白的含量；而給藥組中SOD活力和GSH含量較模型組都有明顯升高，提示 5,7,3’-三乙酰橙皮素可提高肺纖維化大鼠抗氧化損傷的能力。5,7,3’-三乙酰橙皮素的抗脂質過氧化功效為其防治肺纖維化提供藥理學依據，但其干預作用是否呈劑量依賴性還有待進一步研究。

圖3 TAHP治療28 d后各組大鼠肺組織染色 ×200

A：對照組；B：模型組；C：TAHP 50 mg/kg；D：TAHP 100 mg/kg；E：TAHP 200 mg/kg；F：DXM 1.4 mg/kg；1：HE染色；2：Masson染色

肺纖維化是由多種細胞因子啟動、持續性膠原蛋白代謝失衡造成的結果。TGF-β1是迄今發現的最強的細胞增殖調控劑和細胞外基質沉積促進劑[5]，研究[6-7]證實其介導的Smads、ERK信號通路在肺纖維化中起關鍵作用。α-SMA是肌成纖維細胞(myofibroblast, MFb)的標志性蛋白[8-9]，其表達水平可間接反映Fb向MFb轉化增殖的程度。在本實驗中，相較于模型組，5,7,3’-三乙酰橙皮素各劑量組均抑制大鼠肺組織中的TGF-β1和α-SMA的表達，說明 5,7,3’-三乙酰橙皮素能降低肺成纖維細胞向肌成纖維細胞的轉化，從而降低肺纖維化程度。其抑制TGF-β1 mRNA的異常高表達，可能與其抑制TGF-β1介導的下游信號通路、從而最終發揮抗肺纖維化作用有關。

圖4 TAHP治療7、14、28 d后各組大鼠肺組織中HYP、MDA、GSH和SOD的含量

圖5 大鼠肺組織SCF、c-Kit、TGF-β1和α-SMA mRNA的表達

M：Marker;1：對照組；2：模型組；3：TAHP 50 mg/kg組；4：TAHP 100 mg/kg組；5：TAHP 200 mg/kg組；6：DXM 1.4 mg/kg

研究[8-9]表明，SCF/c-Kit信號轉導通路的異常激活與各類細胞的異常增殖有密切關系。早期研究證實的與肺纖維化相關的ERK信號途徑、JAK-STAT通路等[10-12]，均為SCF/c-Kit通路激活的下游信號轉導通路[13]。但SCF/c-Kit通路與肺纖維化的關系尚缺乏研究。本實驗結果顯示：模型組大鼠肺組織中SCF、c-Kit的基因表達較對照組明顯升高，提示SCF/c-Kit通路在博來霉素致大鼠肺纖維化的發生、發展中被激活。SCF為作用于最早期造血干/祖細胞的造血細胞因子，這與已獲證實的肺肌成纖維細胞的分化與骨髓祖細胞招募相關的結論相吻合[14-16]。不同劑量 5,7,3’-三乙酰橙皮素的治療使大鼠肺組織的SCF、c-Kit表達水平有所下降表明：5,7,3’-三乙酰橙皮素可能通過調控SCF/c-Kit干預肺纖維化。

綜上所述，5,7,3’-三乙酰橙皮素對博來霉素致大鼠肺纖維化有一定的治療作用，其機制可能與機體內抗氧化和抑制TGF-β1表達有關。結果顯示SCF/c-Kit信號通路在博來霉素致大鼠肺纖維化中被激活，5,7,3’-三乙酰橙皮素對肺纖維化的干預作用可能與影響SCF/c-Kit有關。