美洲大蠊提取物對大鼠皮膚創傷修復機制探討

魏 操，翟素珍，邰勝燕，肖永珊，張春林

創傷修復一直是醫學外科領域里面臨的最基本最重要的問題之一。隨著中草藥在創面愈合中的作用越來越重要[1]，美洲大蠊(PeriplanetaAmericanaL.)為蜚蠊目蜚蠊科(BlattidaeHandlirsch)大蠊屬(Periplaneta)昆蟲，其藥用可追溯到《神農本草經》，基于美洲大蠊提取物具有抗腫瘤、抗衰老、保肝、強心、修復潰瘍創面等功效，該藥對創面修復的臨床療效良好并得到驗證[2]，但仍存在如蟑螂藥用活性成分不明、藥理機制不清楚等諸多問題。鑒于此，該研究建立了大鼠皮膚切創模型，觀察美洲大蠊粗提物(PeriplanetaAmericanaextract，PAE)對創口愈合過程中的作用，檢測血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)和CD68的表達，旨在觀察PAE促進創傷修復及其藥理作用的機制。

1 材料與方法

1.1主要試劑與儀器HE、Cy-3染色試劑盒(北京索萊寶公司)；CD68抗體(英國Abcam公司)；VEGF抗體(武漢Boster公司)；bFGF抗體(美國Immunaly公司)；β-actin一抗和羊抗兔二抗(北京博奧森公司)；正置熒光顯微鏡(日本Nikon公司)；石蠟切片機(德國LEICA公司)； DK-8D型電熱恒溫水槽(上海一恒科學儀器有限公司)；旋轉蒸發儀(上海亞榮公司)；DYCP-40E型電泳儀(北京六一儀器廠)；蛋白電泳儀(北京百晶生物技術有限公司)；凝膠圖像處理系統(美國伯樂公司)；Bullet Blender組織細胞破碎儀(北京海德創業生物科技有限公司)；京萬紅藥膏(天津藥業有限公司)，批準文號：國藥準字Z12020440。

1.2實驗動物選用SPF級SD大鼠60只，雌雄各半，體質量 (200±20)g，飼養溫度22 ℃，濕度55%～65%，由陸軍醫學院附屬大坪醫院實驗動物中心提供。

1.3PAE的制備[3]稱美洲大蠊100 g，粉碎成粗粉，于50 ℃下烘干，用85%乙醇4 ℃浸泡過夜，依次加7、5、3倍量85%乙醇于60 ℃浸泡2、1.5、1 h，合并3次提取液，趁熱過濾，減壓回收乙醇至粘稠膏狀，再加入1 L溫熱的蒸餾水，攪拌、靜置，于 4 ℃過夜，除去上層油狀物。剩余水溶液加入石油醚萃取，靜置，取下層水溶液及沉淀，濃縮成稠膏，冷凍干燥得浸膏。

1.4實驗方法

1.4.1動物分組 將SPF級SD大鼠60只隨機分為5組：模型組12只，京萬紅組12只，PAE高、中、低組各12只。

1.4.2動物模型的制備 動物模型制備參照文獻[4]。大鼠常規飼養3 d后，7.2%水合氯醛(0.5 ml/100 g)腹腔注射麻醉成功后，備皮，75%的酒精局部消毒手術區，于耳連線中間向下4 cm背部近頸側以脊柱為中線位制作1.5 cm×1.5 cm全層皮膚創口，深至肌層，形成機械損傷動物模型。

1.4.3給藥方法 PAE高中低劑量組分別外涂PAE 250、125、62.5 mg/(g·d)；京萬紅治療組外涂京萬紅藥膏0.1 g/d；模型組常規飼養，不作任何處理。其余4組每日定時局部涂抹給藥1次，持續給藥14 d。

1.5觀察指標及檢測方法

1.5.1創面大體觀察 建模后肉眼觀察創面有無紅腫、滲液及感染，創口收縮和表面結痂的情況。

1.5.2創面愈合率 分別在建模后的第3、7、14天攝取每組大鼠的創面圖像，采用圖像分析軟件(Image J)計算創面面積，得出創面愈合率。

1.5.3病理組織學觀察 從4%多聚甲醛固定液取出組織快，自來水沖洗3～4 h，行常規脫水、包埋、切片(厚約5～6 μm)、染色、封片，光鏡下觀察肉芽組織、毛囊、血管的生成情況，評價創面愈合質量。

1.5.4免疫熒光檢測巨噬細胞CD68的表達 參照1.5.3方法行常規脫水包埋后，PBS洗滌3次，熱抗原修復30 min,山羊血清(PBS稀釋)封閉30 min,滴加稀釋的CD68(1 ∶100)一抗4 ℃孵育過夜，洗滌3次，依次滴加熒光二抗和DAPI顯色劑，孵育30 min, 最后抗熒光衰減劑封片，熒光鏡觀察拍片，統計分析。

1.5.5Western blot法檢測VEGF、bFGF蛋白表達 經研磨后總蛋白經SDS-PAGE(10%)電泳，將蛋白轉至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，滴加VEGF、bFGF一抗4 ℃孵育過夜，TBST洗滌3次，滴加二抗溫育2 h，曝光、顯影。Image J軟件對蛋白條帶結果進行光密度分析，內參對照采用β-actin。

1.6統計學處理使用SPSS 17.0軟件進行分析，采用單因素方差分析，P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1各組大鼠不同時間點肉眼觀察結果建模后第3天，模型組創口稍紅腫、少許滲液，邊緣皮膚開始褶皺。京萬紅組和PAE高、中、低各組創口干凈，創面被一層暗紅色新生薄皮覆蓋，創口邊緣皮膚收縮褶皺明顯。建模后第7天，模型組創面邊緣縮小不明顯，創面被一層暗紅色薄皮覆蓋未結痂。京萬紅組和PAE高、中、低各組創面收縮明顯，創面痂皮較厚并覆蓋整個創面。建模后第14天，模型組創口明顯縮小被肉芽組織填充。京萬紅組和PAE高、中、低各組創面痂皮脫落，被新生表皮覆蓋，瘢痕暗紅。見圖1。

2.2創面愈合率比較建模第0天各組創面面積比較，模型組(3.43±0.25) cm2、京萬紅組(3.57±0.29) cm2、PAE高(3.31±0.29) cm2、中(3.64±0.30) cm2、低(3.65±0.27) cm2組之間差異無統計學意義(F=2.381，P>0.05)。見圖2。治療后第3、7天,京萬紅組和PAE高、中、低組的創面愈合率均高于模型組，差異有統計學意義(F=11.064，P<0.05)，治療后第7天，PAE高中低組間比較， PAE中組愈合率高于PAE低組，差異有統計學意義(F=20.035，P<0.05)；第14天，與模型組比較，京萬紅組和PAE中組差異有統計學意義(F=14.168，P<0.05)。見圖3、表1。

表1 創面愈合過程中各組創面愈合率的比較

與模型組比較：*P<0.05；與PAE中組比較：#P<0.05

2.3HE染色結果與模型組比較，光鏡結果顯示，治療后第3天，PAE中組可見新生毛細血管，成纖維細胞、汗腺細胞增生；治療后第7天，模型組炎細胞浸潤仍較明顯，成纖維細胞和新生血管數量較之前增多，PAE中組可見大量新生血管和成纖維細胞，少量炎細胞浸潤，上皮細胞增生明顯，密集汗腺細胞，導管內徑增大；治療后第14天，模型組成纖維細胞增生明顯，肉芽組織形成，上皮細胞增生明顯，膠原纖維排列紊亂， PAE中組肉芽組織形成明顯，膠原纖維成縱行排列整齊，汗腺細胞和導管大量增生，排列整齊，毛囊較多。見圖4。

圖1 建模后各組創面愈合情況

圖2 各組皮膚創面初始面積比較

圖3 各組不同時間點大鼠皮膚創愈合率比較

2.4膠原纖維染色結果Masson染色結果見圖5～6，治療后第3天，與模型組比較，京萬紅組和 PAE中組膠原纖維增加更明顯，差異有統計學意義(F=37.239，P<0.01)；治療后第7天，PAE高組和PAE低組均高于模型組，差異有統計學意義(F=36.802，P<0.01)。PAE高中低組間比較，與PAE低組比較，PAE高組、PAE中組差異有統計學意義(F=20.247，P<0.05)；第14天，與模型組比較，京萬紅組、PAE高組和PAE低組均減少，差異有統計意義(F=16.231，P<0.05)；PAE中組的膠原纖維明顯減少，差異有統計學意義(F=27.147，P<0.01)；PAE高中低組間比較， PAE中組均顯著少于PAE高組和PAE低組，差異有統計學意義(F=9.663，P<0.05)。

圖4 創傷后第3、7、14天各組HE染色圖 ×200

圖5 創傷后第3、7、14天各組膠原纖維染色圖 ×200

2.5創面肉芽組織中巨噬細胞的變化與模型組比較，第3、7天，京萬紅組和PAE高中低組中CD68陽性細胞數增加，PAE中組增加最明顯；第14天，京萬紅組和PAE高中低組的CD68陽性細胞數減少，PAE中組減少更明顯。見圖7。

2.6創傷愈合過程中VEGF、bFGF蛋白的表達變化

2.6.1VEGF蛋白表達變化 治療后第3天，與模型組比較，PAE 高組和PAE低組VEGF增加，差異有統計學意義(F=11.150，P<0.05)；京萬紅組和PAE中組VEGF表達明顯增高，差異有統計學意義(F=13.681，P<0.01)；PAE高中低組之間比較， PAE中組VEGF均高于PAE高組和PAE低組，差異有統計學意義(F=18.520，P<0.05)。治療后第7天，京萬紅組和PAE中組高于模型組，差異有統計學意義(F=10.120，P<0.05)；PAE中組VEGF均高于PAE高組和PAE低組，差異有統計學意義(F=11.214，P<0.05)。第14天，PAE中組VEGF的表達量減少，差異有統計學意義(F=14.517，P<0.05)。見圖8。

2.6.2bFGF蛋白表達變化 治療后第3、7天，與模型組比較，京萬紅組和 PAE中組bFGF表達量增加，差異有統計學意義(F=22.353，P<0.05；F=9.960，P<0.05)；PAE各組之間比較，與PAE低組比較， PAE中組bFGF表達量增加，差異有統計學意義(F=36.461、12.660，P<0.05)；治療后第14天，與模型組比較，PAE中組bFGF表達減少，差異有統計學意義(F=3.739，P<0.05)。見圖9。

圖6 創傷后第3、7、14天各組膠原纖維光密度值比較

與模型組比較：*P<0.05，**P<0.01；與PAE高、低組比較：#P<0.05

圖7 創傷后第3、7、14天各組CD68陽性細胞數量比較 ×200

圖8 創傷后第3、7、14天各組VEGF光密度值比較

圖9 創傷后第3、7、14天各組bFGF光密度值比較

3 討論

創傷修復是指在外傷或疾病的過程中，造成組織缺損后局部組織通過增生或再生方式進行修補的一系列復雜的病理生理過程。通常，創傷愈合率、病理組織分析是直接而有效的創面愈合的評價指標。通過觀察創面愈合率、HE染色結果和膠原纖維染色結果，證實PAE治療組創面修復的質量和速率較模型組優越，說明PAE能更好的促進創面修復。

CD68是巨噬細胞膜表面分子，是檢測巨噬細胞存在的標志。Brochhausen et al[5]在實驗中闡明在創傷炎癥階段CD68高表達通過吞噬病原體和分泌多種酶降解細胞外基質減輕炎癥反應，在增殖階段，大量CD68分泌細胞生長因子和趨化因子誘導組織的增生。Venosa et al[6]在實驗中指出在增殖期肺損傷和修復與M2型(抗炎)巨噬細胞的積累有關，本實驗結果與之一致。說明在創傷早中期CD68的高表達可能與巨噬細胞分化成M1型：通過吞噬作用減輕創面的炎癥反應，同時也分化成M2型：分泌更多細胞因子促進肉芽組織生長有關，這點在牛軼雯 等[7]實驗結果中已證實，創傷后期CD68低表達可能通過信號通路抑制CD68分泌更多的細胞因子防止創面肉芽組織過度生長形成瘢痕疙瘩。

VEGF是高度特異性促進血管內皮細胞生長因子，bFGF是來源于單核巨噬細胞或淋巴細胞的生長因子，卞明心 等[8]和Zhang et al[9]的實驗中明確指出在創傷修復的早中期階段通過刺激VEGF的表達促進新生毛細血管形成。Zhao et al[10]實驗中發現通過增加bFGF表達加速細胞增殖促進創傷愈合，Lin et al[11]實驗中發現通過下調VEGF和MMPS蛋白的表達來抑制肺癌細胞的生長。Akasaka et al[12]發現在創傷修復早期，細胞增殖超過細胞凋亡。因能促進肉芽組織形成，在創傷后期，細胞凋亡增加因使肉芽成長抑制,本實驗結果與之一致。創傷早中期， VEGF、bFGF蛋白的高表達可能使創面快速地從炎癥階段過度到肉芽組織增生階段，加速創面的成纖維細胞、毛細血管和細胞外基質快速生長，創傷后期， VEGF、bFGF蛋白明顯下調，可能通過膠原纖維的合成與分解使膠原蛋白含量在新生的血管結締組織中達到相對平衡，有效減少創面瘢痕的形成。

綜上所述，PAE中組能更好地提高創面愈合速率，促進膠原沉積，毛細血管新生，成纖維細胞遷移和肉芽組織形成的作用，其藥理機制可能與創傷修復不同階段CD68分化和VEGF、bFGF表達有關，為進一步研究奠定基礎。