參麥注射液對重癥急性胰腺炎大鼠腸黏膜屏障功能的保護作用

古凌燕，宋振順

(1.同濟大學醫學院；2.同濟大學附屬第十人民醫院，上海 200333)

重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)發病急，病情重，并發癥多，病死率高，目前病死率仍達10%～30%，胰腺和胰周的繼發感染是影響急性胰腺炎死亡率的重要因素[1]。腸屏障功能損傷所引起的早期細菌易位被認為的是胰腺繼發感染的重要原因[2]，所以防治腸屏障功能損害導致的細菌及內毒素等腸源性有害物質的移位對阻止SAP發展，改善患者的預后至關重要。

參麥注射液在急性胰腺炎的臨床治療中顯示確切的療效，可緩解患者的臨床癥狀和體征，同時又能降低實驗室相關指標[3]，縮短住院時間[4]。在動物實驗中發現參麥注射液對SAP模型大鼠多個器官功能均有保護作用[5]，并且在腸系膜血管缺血再灌注大鼠模型中證實了對腸黏膜屏障功能具有保護作用[6]，但目前有關參麥注射液對SAP腸屏障功能是否有保護作用尚不清楚。本實驗將應用牛磺膽酸鈉建立大鼠SAP模型，應用參麥注射液干預，觀察腸道病理變化，通過檢測腸道炎癥因子、腸道屏障通透性指標、腸道氧化應激指標探討參麥注射液對SAP腸黏膜屏障功能是否有保護作用及可能的作用機制，為臨床治療SAP伴腸屏障損害、進一步降低感染率、降低死亡率提供新的思路及實驗依據。

1 材料與方法

1.1 試劑

參麥注射液購自正大青春寶藥業有限公司(國藥準字 Z33020020,生產批號1706054 )，牛磺膽酸鈉購自美國sigma公司，大鼠血清D-乳酸試劑盒購自美國BioVision公司，大鼠DAO、TNF-ɑ及IL-10 ELISA試劑盒購自美國R&D公司，丙二醛(MDA)及超氧化物岐化酶(SOD)試劑盒購自南京建成生物工程研究所；其余實驗室常規試劑購自上海欲立生物科技有限公司。

1.2 動物與分組

6—8周齡清潔級雄性SD大鼠24只，體質量(200±20) g，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供。按隨機數字表法分為假手術組、SAP模型組，參麥注射液治療組，每組8只。

1.3 造模及給藥

采用胰膽管逆行性注入5%牛磺膽酸鈉1 mL/kg體質量的方法制備SAP模型。對照組僅開腹翻動十二指腸并觸摸胰腺數次后關腹。參麥治療組制模后30 min參麥組均經尾靜脈給予5 mL/kg參麥注射液，對照組和SAP組注射等量生理鹽水。

1.4 標本采集

腹腔注射2.5%戊巴比妥鈉(2.5 mL/kg)麻醉，于腹主動脈取血，收集血液后以3 500 r/min離心15 min，取上清，將血漿保存于-80 ℃冰箱待測。取2 cm腸段于凍存管中，-80 ℃冰箱凍存，用于制作腸組織勻漿。

1.5 指標檢測

1.5.1 大鼠血漿DAO測定 采用ELISA法測定，具體操作按試劑盒說明書進行，使用Bio-rad608酶標儀儀于450 nm處進行吸光度測定，繪制標準曲線，計算出血漿二胺氧化酶DAO的濃度。

1.5.2 大鼠血漿D-乳酸水平測定 采用酶偶聯紫外分光光度法檢測血清中D-乳酸水平，原理是D-乳酸被D-乳酸脫氫酶特異性氧化，按其比例產生顏色，可在450 nm處檢測。具體操作按說明書進行，采用Bio-rad608酶標儀進行測定，繪制標準曲線，計算出D一乳酸濃度。

1.5.3 小腸組織中MDA含量及SOD活性測定 將凍存腸道組織放入EP管，放入9倍生理鹽水，用組織勻漿機進行粉碎，將制備好的10%勻漿用低溫離心機3 500 r/min左右離心15 min，將離心好的勻漿置入EP管待測。用硫代巴比妥酸比色法測定MDA，用黃嘌呤氧化法測定SOD的活性變化，按測試盒說明書步驟操作。

1.5.4 小腸組織中TNF-ɑ及IL-10的測定 將凍存腸道組織放入EP管，放入9倍生理鹽水，用組織勻漿機進行粉碎，將制備好的10%勻漿用低溫離心機3 500 r/min左右離心15 min，將離心好的勻漿置入EP管待測。用ELISA法檢測TNF-ɑ及IL-10水平，具體操作步驟按說明書進行。采用酶標儀儀于450 nm處進行吸光度測定，繪制標準曲線，計算出TNF-ɑ及IL-10的濃度。

1.6 統計學分析

2 結果

2.1 3組大鼠血清DAO、D-乳酸水平比較

如表1所示，與假手術組相比，SAP組DAO及D-乳酸水平明顯增高(P<0.05)；治療組可明顯降低SAP引起的DAO及D-乳酸水平升高(P<0.05)。

表1 3組大鼠血清DAO、D-乳酸水平比較

*P<0.05，與假手術組比較；#P<0.05，與SAP組比較。

2.2 3組大鼠小腸勻漿MDA、SOD水平比較

如表2所示，與假手術組相比，SAP組腸組織MDA含量明顯升高(P<0.05)，SOD活性明顯降低(P<0.05)；而治療組可明顯降低SAP引起的MDA水平升高(P<0.05)，逆轉SOD活性下降(P<0.05)。

表2 3組大鼠小腸勻漿MDA、SOD水平比較

*P<0.05，與假手術組比較；#P<0.05，與SAP組比較。

2.3 3組大鼠小腸勻漿TNF-ɑ、IL-10水平比較

如表3所示，與假手術組相比，SAP組腸組織TNF-ɑ水平明顯升高(P<0.05)，IL-10水平明顯升高(P<0.05)；而治療組可明顯降低SAP引起的TNF-ɑ水平升高(P<0.05)，并提高IL-10水平(P<0.05)。

表3 3組大鼠小腸勻漿TNF-ɑ、IL-10水平比較

*P<0.05，與假手術組比較；#P<0.05，與SAP組比較。

3 討論

SAP的高病死率主要因繼發急性呼吸功能衰竭、膿毒癥以及多器官功能衰竭(MODS)所致[7]。動物實驗及臨床研究表明，胰腺炎發病后不久便出現腸道通透性的增加，而且腸道屏障功能損傷的程度已被證明與膿毒癥、MODS相關[8-9]。DAO是位于腸黏膜上絨毛細胞中高度活性的細胞內酶，尤以空、回腸活性最高。腸黏膜損傷嚴重時，大量DAO隨著壞死脫落的腸黏膜細胞進入腸腔以及釋放入血，導致腸黏膜內DAO活性降低，而血和腸腔中DAO活性增高。由于血中DAO活性相對穩定，是反映腸道黏膜上皮細胞完整性的血漿標記物[10]。D-乳酸是腸道多種細菌的代謝產物，正常情況下不被吸收降解，腸黏膜通透性增加時，腸道中大量D-乳酸釋放入血，故檢測D-乳酸水平可反映腸黏膜損傷程度[11]。本研究發現，SAP組大鼠血DAO活性及D-乳酸水平均較假手術組顯著上升，參麥注射液治療可有效抑制這兩個指標的上升，說明參麥注射液治療對SAP大鼠腸黏膜屏障功能障礙有一定的保護作用。

SAP早期，白細胞的過度激活會引起腫瘤壞死因子、白介素等細胞因子的瀑布樣釋放，導致嚴重的黏膜損傷，繼而腸黏膜通透性增加導致細菌與內毒素移位，后者又加重這一過程，最終導致MODS[12-13]。在眾多炎性因子中TNF-a起關鍵作用，它可誘導其他細胞因子如IL-1、IL-6等的產生和釋放，使炎癥信號進一步放大和加強，產生“級聯放大”作用，最終導致過重的炎癥反應及細胞損害[14-16]。IL-10是一種主要由單核細胞和T淋巴細胞分泌的抗炎介質，能直接或間接抑制其他炎性介質如IL-6、TNF-α等促炎細胞因子的合成與釋放，減輕炎癥反應的程度；同時也可抑制胰腺炎細胞凋亡，改善胰腺組織微循環，對AP具有良好的保護作用[17]。本實驗發現參麥注射液治療可明顯降低小腸組織TNF-α水平，同時提高IL-10水平，有效減輕腸道炎癥反應，減輕病理損傷。

研究發現，缺血和缺血/再灌注(I/R)損傷是造成腸道病理學損傷的重要組合因素[18]。由于腸道本身的高代謝及絨毛微血管結構的特性，腸道對灌注不足非常敏感，絨毛頂部黏膜細胞極易發生缺血性損害[19]。而缺血組織再灌注時造成的微血管和實質器官的損傷主要是由活性氧自由基引起的，這已在多種器官中得到的證明。腸黏膜中含有豐富的黃嘌呤氧化酶，當缺血再灌注損傷發生時，腸黏膜細胞發生的氧化應激更為強烈，損傷更加嚴重。已有研究表明氧自由基可損傷細胞線粒體，導致鈣超載,引起細胞內酶的活化，細胞水腫及細胞骨架的破壞，促使細胞凋亡[20]。活性氧和活性氮還能夠通過破壞黏液層的黏度，疏水性，破壞腸屏障功能[21]。有研究發現，離體胰腺腺泡細胞在沒有炎性因子的環境中，活性氧自由基能夠激活核轉錄因子(NF-κB)，進而促使細胞因子的釋放，進一步加重腸黏膜屏障的損害[22]。MDA含量是組織脂質過氧化的一種指標，間接反映細胞損傷程度。SOD是生物抗氧化系統的重要酶類之一，能有效減輕有害氧自由基對細胞的損害，其活力可間接反映組織的抗氧化能力。因此，兩者是衡量機體氧化及抗氧化平衡的重要檢測指標。本研究發現參麥治療組可明顯降低小腸組織MDA水平，逆轉SOD活性下降，表明參麥注射液可能通過抑制氧自由基的產生，對SAP腸道損傷產生保護作用，這與既往報道的參麥注射液具有抗氧化效應相符[6]。

綜上所述，參麥注射液可對重癥急性胰腺炎導致的腸黏膜功能障礙起保護作用，其機制可能與調節抗炎抑炎因子表達，抑制氧化應激有關。本研究雖表明參麥注射液具有抗炎、抗氧化作用，但其中是否還存在其他作用機制，作用靶點以及信號通路尚不清楚，未來仍需進一步研究。