長鏈非編碼RNA PlncRNA-1在前列腺癌中的表達及其意義

黃勇，閆駿

(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院泌尿外科，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010059)

前列腺癌是男性泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一[1]。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類長度介于200 nt-100 kb之間的非編碼RNA，主要位于細胞核與細胞質(zhì)中，可在真核細胞中普遍被轉(zhuǎn)錄[2-3]。目前研究[4]發(fā)現(xiàn)，lncRNA參與了包括基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控、介導(dǎo)染色質(zhì)重建及組蛋白修飾等一系列重要的細胞活動。新近有研究[5]發(fā)現(xiàn)一種新的lncRNA與包括前列腺癌等多種惡性腫瘤性疾病的發(fā)病有關(guān)，該lncRNA被稱為PlncRNA-1。筆者通過對前列腺癌患者病理標本及前列腺癌標準細胞株中PlncRNA-1的表達及其在疾病發(fā)病中的可能機制進行了相關(guān)研究，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 材料

人前列腺癌細胞株LNCaP購自上海細胞庫； RNA反轉(zhuǎn)錄試劑、siRNA轉(zhuǎn)染試劑購自TaKaRa公司，siRNA由上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司合成；鼠抗人CyclinD1及β-actin抗體均購自Santa Cruz公司；Trizol、Lipofectamine2000試劑購自Invitrogen公司；PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 組織標本

所有組織標本均來源于內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院接受手術(shù)切除的患者，術(shù)后病理證實為前列腺癌者12例(Pca組)，另選擇12例良性前列腺增生標本為對照組(BHP組)。所有患者均簽署知情同意書，相關(guān)內(nèi)容獲醫(yī)學(xué)倫理委員會批準。

1.3 干擾PlncRNA-1的siRNA等引物的設(shè)計與合成

PlncRNA-1干擾序列及對照序列均由上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司合成，具體序列如表1所示。

表1 PlncRNA-1干擾序列及對照序列

1.4 細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

LNCaP細胞的培養(yǎng)條件：采用含100 ml/L胎牛血清的1640培養(yǎng)基，置于37℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

細胞轉(zhuǎn)染：當LNCaP細胞匯合度達到約80%后，通過Lipofectamine2000介導(dǎo)的方法將將siRNA轉(zhuǎn)入細胞中，具體操作步驟詳見說明書。根據(jù)轉(zhuǎn)染與否將細胞分別命名為PlncRNA-1-siRNA組、對照組(NC組)。

1.5 PlncRNA-1 mRNA水平的檢測

收集待測細胞，參考試劑說明書提取細胞總RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以此cDNA為模板，擴增目的基因。PlncRNA-1、內(nèi)參照β-actin引物序列如表2。qRT-PCR反應(yīng)條件為：95 ℃ 3 min，95 ℃ 10 s，55 ℃ 30 s，共40個循環(huán)，實驗重復(fù)3次。

表2 PlncRNA-1及β-actin引物序列

1.6 Cyclin D1蛋白水平的檢測

收集經(jīng)轉(zhuǎn)染PlncRNA-1-siRNA組、NC組 48 h后，采用PBS溶液洗滌2次(每次間隔5 min)，離心后棄上清，隨后加入50 μL細胞裂解液，冰上裂解30 min以充分裂解細胞后，在12 000 rmp下離心15 min(4 ℃)，取其上清。加入上樣緩沖液，經(jīng)100 ℃(5 min)變性后用100 g/L的SDS-PAGE分離，轉(zhuǎn)移至NC膜。用含50 g/L脫脂奶粉封閉1 h(20 ℃)。分別加入Cyclin D1 (1∶1000)、β-actin(1∶3000)一抗，4 ℃條件下孵育過夜后，采用TBST洗滌3次(每次間隔5 min)。隨即加入二抗(1∶3000)并于室溫下孵育1 h，TBST洗滌3次。然后分別加入A、B顯色劑1 min顯色觀察。

1.7 CCK-8法檢測細胞增殖速率

分別取第1、2、3、4、5天 PincRNA-1-siRNA組、NC組細胞以2×106/mL接種于96孔培養(yǎng)板中，平行接種兩組，每個實驗條件設(shè)3個復(fù)孔，每孔100 μL培養(yǎng)體系。在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，一組每孔分別加入10 μL的CCK-8試劑，培養(yǎng)箱中孵育1 h，酶聯(lián)儀檢測細胞的450 nm處吸光度值。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 PlncRNA-1在腫瘤組織中的表達

本組資料共收集前列腺癌(Pca)患者標本組織12例及正常前列腺增生(BHP)組織12例。兩組患者在年齡分布上未見統(tǒng)計學(xué)差異。通過qRT-PCR方法檢測兩組組織中PlncRNA-1 mRNA水平。觀察發(fā)現(xiàn)，前列腺癌患者組織標本中PlncRNA-1 mRNA表達水平(2.48±0.37)，較正常前列腺組織(1.19±0.28)顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.031)，見圖1。

2.2 PlncRNA-1在PlncRNA-1-siRNA組及NC組細胞中的差異表達

對比發(fā)現(xiàn)，經(jīng)siRNA下調(diào)細胞株中PlncRNA-1，其PlncRNA-1 mRNA相對表達量為(1.43±0.69)，較NC組細胞株(2.54±0.41)明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.028)，見圖2。

2.3 下調(diào)PlncRNA-1對LNCaP細胞內(nèi)周期蛋白Cyclin D1表達的影響

采用Western Blot方法檢測兩組細胞株中細胞周期蛋白Cyclin D1表達水平，觀察發(fā)現(xiàn)，經(jīng)siRNA下調(diào)PlncRNA后，其細胞內(nèi)Cyclin D1蛋白水平(1.13±0.22)顯著低于對照組的(0.34±0.18)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖3。

2.4 下調(diào)PlncRNA-1對LNCaP細胞增值速率的影響

采用CCK-8法檢測PlncRNA-1-siRNA組、NC組細胞增殖速率間差異發(fā)現(xiàn)，PlncRNA-1下調(diào)后，LNCaP細胞株的增殖速率顯著下降，在第5天時最為明顯，與同時點NC組細胞組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖4。

3 討論

前列腺癌是男性泌尿系統(tǒng)最為常見的惡性腫瘤之一，近年來其發(fā)病率有增高趨勢，嚴重威脅人群健康[6]。此前認為，前列腺癌是一種雄激素依賴性腫瘤，然而隨著近年來的研究發(fā)現(xiàn)，其往往表現(xiàn)為較強的異質(zhì)性[7-9]。這表明，在前列腺癌發(fā)病過程中，有著除雄激素以外其他因素的參與。生命活動的調(diào)控都是由生物體內(nèi)遺傳物質(zhì)——基因決定的。在通過對人類在內(nèi)的多種生物體基因組研究過程中發(fā)現(xiàn)，絕大部分基因并沒有轉(zhuǎn)錄為特定的蛋白質(zhì)分子參與生命活動，更多是參與轉(zhuǎn)錄基因的表達調(diào)控過程，這其中就包括非編碼RNA[10]。目前針對非編碼RNA的研究逐漸成為熱點，也讓人們逐漸認識到這些為轉(zhuǎn)錄的基因分子在生命活動中的重要性。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類長度介于200 nt-100 kb的非編碼RNA，主要位于細胞核與細胞質(zhì)中，可在真核細胞中普遍被轉(zhuǎn)錄。與mRNA相比，lncRNA分子結(jié)構(gòu)上沒有典型的開放閱讀框，無法編碼或很少編碼相應(yīng)的蛋白質(zhì)分子[11-12]。新近研究發(fā)現(xiàn)，這些lncRNA分子在胚胎發(fā)育過程中具有激活細胞全能性的特點，對細胞周期具有顯著的調(diào)節(jié)作用[13-14]。

PlncRNA-1被認為與前列腺癌有著密切相關(guān)性，前期相關(guān)研究[15-16]發(fā)現(xiàn)，在前列腺癌標本中，能夠檢測到較高水平的PlncRNA-1表達。在本研究中也發(fā)現(xiàn)了一致的結(jié)果。無論在前列腺癌患者病變組織標本中，亦或是前列腺癌細胞株中，PlncRNA-1 mRNA的表達水平均明顯增高，表明PlncRNA-1在前列腺癌發(fā)病中起到了積極作用。然而對于升高的具體意義，目前暫無統(tǒng)一認識。本組研究中，通過比較觀察PlncRNA-1對前列腺癌細胞株細胞周期的影響試圖探討其可能的作用機制。筆者通過siRNA技術(shù)干擾腫瘤細胞株內(nèi)PlncRNA-1的表達，檢測其對細胞周期蛋白Cyclin D1表達水平的影響，觀察發(fā)現(xiàn)，與未處理的細胞株(NC組)相比，PlncRNA-1下調(diào)的細胞株中，Cyclin D1蛋白表達水平顯著下降，而Cyclin D1蛋白是參與細胞增殖的重要蛋白，其水平的增高可促進細胞的增殖。這表明，PlncRNA-1具有促進Cyclin D1蛋白表達的作用，這也進一步表明其具有促進細胞增殖的作用。進一步研究發(fā)現(xiàn)，與NC組細胞株相比，PlncRNA-1下調(diào)后細胞株其細胞增殖速率顯著降低，這也再次表明，PlncRNA-1對前列腺癌細胞具有顯著的促增殖作用。

綜上所述，長鏈非編碼RNA PlncRNA-1的高表達參與了前列腺癌的發(fā)病過程，促進細胞周期蛋白Cyclin D1的表達從而促進腫瘤細胞增殖可能是其參與發(fā)病的機制之一。然而，受樣本數(shù)量等客觀因素的限制，數(shù)據(jù)偏倚在所難免，今后將擴大樣本量進一步深入研究與上、下游相關(guān)分子的相關(guān)性，以期更進一步明了PlncRNA-1的具體機制。