一種低成本的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染白血病細(xì)胞的方法探析

張慧娟，張 伶，胡 蓉，江麗霞，鐘田雨

對于中小城市的科研實(shí)驗(yàn)室來說，科研經(jīng)費(fèi)嚴(yán)重不足，科研設(shè)備不齊全。一旦涉及基礎(chǔ)研究如載體構(gòu)建，科研人員只有去花一筆不菲的費(fèi)用去公司購買載體。該研究采用低成本的磷酸鈣轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄病毒的包裝，并用病毒原液成功感染懸浮細(xì)胞—KG-1a白血病細(xì)胞，大大節(jié)省了科研費(fèi)用，同時(shí)解決懸浮細(xì)胞難轉(zhuǎn)染的問題，對于在一般科研條件下做基礎(chǔ)研究的科研人員，具有很大的參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1主要試劑磷酸鈣轉(zhuǎn)染試劑的配制：2 mol/L CaCl2(將29.4 g CaCl2溶于100 ml水，過濾后備用)和2×HBSS(將3.273 g NaCl2、0.149 g KCl、0.043 g Na2HPO4、0.43 g無水葡萄糖、2.338 g HEPES溶于180 ml的水，平均分至2瓶，分別調(diào)節(jié)pH至6.95和7.05，加水至100 ml，過濾后備用)。磷酸鈣轉(zhuǎn)染試劑、polybrene和嘌呤霉素均購自美國Sigma公司；RPMI 1640培養(yǎng)基和DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；胎牛血清購自美國Hyclone公司。

1.2質(zhì)粒、菌種和細(xì)胞培養(yǎng)MSCV-PIG(攜帶綠色熒光蛋白GFP)、Gag-pol、VSVG逆轉(zhuǎn)錄病毒載體由美國安德森實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)，pSES-HUS(攜帶紅色熒光蛋白R(shí)FP)質(zhì)粒、逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細(xì)胞293T細(xì)胞、人白血病細(xì)胞株KG-1a由贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院科研中心保存。在37 ℃、5% CO2的條件下用含10%的胎牛血清，青霉素(100 U/ml)、鏈霉素(100 U/ml)和L-谷氨酰胺(2 mol/L)的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)293T細(xì)胞，RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)KG-1a細(xì)胞。

1.3磷酸鈣轉(zhuǎn)染試劑最佳pH值選擇將pSES-HUS 轉(zhuǎn)染入293T細(xì)胞，將pH為6.95和pH為7.05的HBSS按1 ∶9、2 ∶8、3 ∶7……10 ∶0各配1 ml，轉(zhuǎn)染時(shí)應(yīng)用各種配比的HBSS，轉(zhuǎn)染48 h后鏡下觀察細(xì)胞紅色熒光表達(dá)強(qiáng)弱。

1.4逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝

1.4.1轉(zhuǎn)染 準(zhǔn)備好兩個(gè)EP管：A管和B管。A管加入CaCl262.5 μl、MSCV-PIG 10 μg、Gag-pol 7.5 μg和VSVG 2.5 μg，振蕩混勻。B 管為500 μl最佳pH的HBSS溶液。將B液加入A管：A管放在振蕩器上，左手拿住A管的上端，右手將B液一滴一滴加入A管，該過程要持續(xù)1～2 min。加完樣之后，會(huì)有細(xì)小的白色沉淀出現(xiàn)，靜置30 min。將長在10 cm平皿融合度達(dá)60%的293T細(xì)胞去上清液，加入8 ml 高糖DMEM。將1 ml CaCl2-DNA-HBSS混合液均勻地一滴一滴滴入平皿, 輕輕混勻，放37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育。6～8 h后換普通培養(yǎng)基。

1.4.2病毒原液收集和感染KG-1a細(xì)胞 轉(zhuǎn)染48 h后收集293T細(xì)胞上清液，立即在平皿里加入10 ml DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)293T細(xì)胞。病毒原液常溫800 r/min離心5 min，用0.45 μm濾器過濾上清液以除去細(xì)胞碎片。再加入2 ml新鮮DMEM培養(yǎng)基，加入12 μl的polybrene，使polybrene終濃度為4 g/L，混勻。加入含KG-1a細(xì)胞的6孔板，2 ml/孔。用膠條封板，22 ℃、1 800 r/min，離心45 min后放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱。轉(zhuǎn)染72 h后第二次收集病毒上清液，再次感染KG-1a細(xì)胞，步驟同上。

圖1 不同pH值的HBSS溶液轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后48 h熒光圖和白光圖 ×400

A、 F：pH 6.95與pH 7.05的HBSS溶液體積比為6 ∶4轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后48 h熒光圖和白光圖；B、G：體積比為7 ∶3時(shí)的熒光圖和白光圖；C、H：體積比為8 ∶2時(shí)的熒光圖和白光圖；D、I：體積比為9 ∶1時(shí)的熒光圖和白光圖；E、J：體積比為10 ∶0時(shí)的熒光圖和白光圖

1.5KG-1a細(xì)胞穩(wěn)篩病毒感染細(xì)胞3 d后，用含嘌呤霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基換液，嘌呤霉素終濃度為2 g/L。穩(wěn)篩出靶細(xì)胞后，將嘌呤霉素終濃度每2 d從2 g/L依次降為1.5、1、0.5、0 g/L。

2 結(jié)果

2.1獲取磷酸鈣轉(zhuǎn)染法中HBSS溶液的最佳pH磷酸鈣轉(zhuǎn)染法中HBSS溶液的pH對轉(zhuǎn)染效率有非常大的影響，為了獲取最佳pH，本研究將pH 6.95和pH 7.05的HBSS溶液按不同比例混合，將攜帶紅色熒光的pSES-HUS質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞，結(jié)果顯示在pH 6.95與pH 7.05的HBSS溶液體積比在6 ∶4、7 ∶3、8 ∶2、9 ∶1和10 ∶0時(shí)鏡下觀察到明顯的紅色熒光，且pH 6.95與pH 7.05的HBSS溶液體積比值為8 ∶2時(shí)熒光最多，轉(zhuǎn)染效率約為40%，表明此時(shí)為最佳轉(zhuǎn)染pH。見圖1。因此，將以此pH的HBSS做后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2逆轉(zhuǎn)錄病毒感染KG-1a細(xì)胞48h后熒光效率磷酸鈣法將MSCV-PIG、Gag-pol和VSVG 逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染入293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h和72 h后分別收集病毒原液感染KG-1a細(xì)胞。感染48 h后KG-1a細(xì)胞熒光比較稀少和微弱，熒光感染效率約為10%，見圖2。

2.3藥物穩(wěn)篩KG-1a細(xì)胞后的熒光效率逆轉(zhuǎn)錄病毒感染KG-1a細(xì)胞3 d后，加入2 g/L 嘌呤霉素進(jìn)行穩(wěn)篩，攜帶有MSCV-PIG逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的KG-1a細(xì)胞具有抗嘌呤霉素抗性，能在藥物篩選中存活。藥物篩選后KG-1a細(xì)胞熒光增多，熒光變亮，其感染效率大于85%。見圖3。

圖2 逆轉(zhuǎn)錄病毒感染KG-1a細(xì)胞后48 h熒光圖和白光圖 ×400

A：逆轉(zhuǎn)錄病毒感染KG-1a細(xì)胞后48 h熒光圖；B：逆轉(zhuǎn)錄病毒感染KG-1a細(xì)胞后48 h白光圖

圖3 嘌呤霉素篩選KG-1a細(xì)胞 ×400

A：加入2 g/L 嘌呤霉素篩選KG-1a細(xì)胞熒光圖；B：加入2 g/L 嘌呤霉素篩選KG-1a細(xì)胞白光圖

2.4病毒感染靶細(xì)胞中需要注意的問題Polybrene過量會(huì)殺死靶細(xì)胞，當(dāng)加入8 g/L polybrene時(shí)，KG-1a細(xì)胞出現(xiàn)皺縮，胞內(nèi)有細(xì)胞碎片，見圖4A箭頭所示；嘌呤霉素過量也會(huì)殺死靶細(xì)胞，當(dāng)加入4 g/L嘌呤霉素時(shí)，細(xì)胞膜完全破碎，細(xì)胞碎片分散，只留下細(xì)胞影，見圖4B箭頭所示。

3 討論

目前，基因干擾或過表達(dá)已經(jīng)成為實(shí)驗(yàn)室研究基因功能的常規(guī)手段。無論是干擾或過表達(dá)，都需要質(zhì)粒轉(zhuǎn)染或病毒感染靶細(xì)胞。對于懸浮細(xì)胞，尤其是白血病細(xì)胞株，用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染或腺病毒感染，其轉(zhuǎn)染或感染效率都非常低，只有用逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒感染效果好。本研究通過磷酸鈣轉(zhuǎn)染方法獲取逆轉(zhuǎn)錄病毒，采用病毒原液感染白血病細(xì)胞，并做穩(wěn)篩，獲取高感染率的目的細(xì)胞，在降低實(shí)驗(yàn)成本的同時(shí)也解決了懸浮細(xì)胞難轉(zhuǎn)染的問題，為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究奠定基礎(chǔ)。

圖4 polybrene或嘌呤霉素過量對KG-1a細(xì)胞的影響 ×400

A：加入8 g/L polybrene對KG-1a細(xì)胞的影響；B：加入4 g/L嘌呤霉素對KG-1a細(xì)胞的影響

磷酸鈣轉(zhuǎn)染法與常用的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法相比，經(jīng)濟(jì)實(shí)惠，價(jià)格低廉，適合進(jìn)行大規(guī)模的病毒包裝，但是，要獲得高效穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染效率仍舊是實(shí)驗(yàn)研究中要面臨的難題[1]。影響磷酸鈣法轉(zhuǎn)染效率的兩個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)是HBSS的pH值和形成的磷酸鈣顆粒大小。本研究將不同體積比的pH 6.95和pH 7.05的HBSS溶液混合，結(jié)果顯示只有在8 ∶2時(shí)293T細(xì)胞熒光最多，轉(zhuǎn)染效率最高，而在其他比例如0 ∶9、1 ∶8中，紅色熒光稀少?？梢?，在極小范圍內(nèi)改變pH值，可以極大地影響轉(zhuǎn)染效率。這也可能是在實(shí)驗(yàn)中為何使用商品化的磷酸鈣轉(zhuǎn)染試劑，總是轉(zhuǎn)染效果不佳的原因。另外一個(gè)影響磷酸鈣法轉(zhuǎn)染效率的是磷酸鈣顆粒大小。有研究[2]表明形成1～3 μm大小的磷酸鈣顆粒對提高磷酸鈣法轉(zhuǎn)染效率非常關(guān)鍵。本研究是將HBSS溶液逐滴地加入在振蕩中的CaCl2-DNA混合物中，隨后靜置30 min，這樣才能形成最佳大小的磷酸鈣沉淀。漩渦振蕩的時(shí)間長短會(huì)影響轉(zhuǎn)染效率[3]。

逆轉(zhuǎn)錄病毒液離心過濾后，與6孔板內(nèi)KG-1a細(xì)胞共孵育，同時(shí)加入polybrene。采用旋轉(zhuǎn)法在22 ℃、1 800 r/min離心45 min，可以加大病毒顆粒與KG-1a細(xì)胞的接觸面，增加病毒感染效率。Polybrene是一種多聚陽離子聚合物，廣泛用于病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染，有助于提高病毒感染效果[4-5]。其作用機(jī)制可能是通過中和細(xì)胞表面唾液酸與病毒顆粒之間的靜電排斥從而促進(jìn)吸附作用。研究[6]報(bào)道，與用病毒原液比較，采用病毒濃縮液細(xì)胞感染效率可大大提高。但是，病毒濃縮提純需要超速離心或購買商品化的純化柱純化。對于中小城市的實(shí)驗(yàn)室，一般并不具備進(jìn)行病毒濃縮的超速離心機(jī)，而購買純化柱純化，太過昂貴。本研究采用未經(jīng)濃縮的病毒原液感染白血病KG-1a細(xì)胞，其感染率確實(shí)低，只有10%左右。但是，經(jīng)過嘌呤霉素穩(wěn)篩，攜帶病毒載體的靶細(xì)胞陽性率可以高達(dá)85%，完全滿足后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究。

在病毒感染靶細(xì)胞過程中，還需要注意：polybrene過量或嘌呤霉素過量都可能殺死靶細(xì)胞。因此，在實(shí)驗(yàn)時(shí)，最好先做預(yù)實(shí)驗(yàn)篩選出最佳的藥物濃度，既不損傷細(xì)胞又可獲得最佳的感染效率。此外，還有許多實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)需要注意：轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的量要足夠多，以保證后面包裝出足夠量的病毒感染靶細(xì)胞；嘌呤霉素穩(wěn)篩出靶細(xì)胞后，進(jìn)行藥物撤離時(shí)，必須逐漸降低藥物濃度，而不能立刻將藥物濃度降為零，否則，靶細(xì)胞非常容易死亡。

本研究采用價(jià)格低廉的磷酸鈣轉(zhuǎn)染法進(jìn)行病毒包裝。創(chuàng)新之處在于用旋轉(zhuǎn)離心法將病毒和靶細(xì)胞共孵育，采用未經(jīng)濃縮的病毒原液感染難轉(zhuǎn)染的白血病細(xì)胞，并通過藥物成功地穩(wěn)篩出陽性細(xì)胞株，保證后續(xù)研究。這對于需要做基礎(chǔ)研究但科研條件一般的實(shí)驗(yàn)室來說，具有重要的借鑒價(jià)值。