肺腺癌中Napsin A、SP-A蛋白的表達和EGFR基因突變及臨床相關性

王學文，郝佳潔，周 菲，孫曉男，常 晨，蔡 巖，徐 昕，王明榮，賈雪梅

肺腺癌是肺癌的一種，且是最常見的一種病理類型。在中國，肺癌是發病率最高的腫瘤也是癌癥死因之首。根據其組織學特點，肺癌可分為非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)和小細胞肺癌，肺腺癌屬于NSCLC[1]。不同類型的肺癌治療方法不同，準確判斷腫瘤的病理分型非常重要。天冬氨酸蛋白酶A(novel aspartie proteinase A, Napsin A)是天門冬氨酸蛋白酶家族成員，參與表面活性物質蛋白的水解過程，起到誘導蛋白前體成熟、維持肺的形態及正常功能的作用。Napsin A 在Ⅱ型肺泡上皮和原發性肺腺癌中有特異性表達[2]。表面活性蛋白A(surfactant protein A, SP-A)是肺表面活性物質重要組成成分，屬于C型凝集素家族重要成員，在維持表面活性劑的穩定和防御呼吸道病原體中起著重要的作用[3]。Napsin A蛋白和SP-A蛋白常用于肺腺癌的診斷和鑒別診斷[4-6]。表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)是人表皮生長因子受體(human epidermal growth factor receptor, HER)家族成員之一，由胞外區、跨膜區和胞內區三部分組成。EGFR信號通路對細胞的生長、增殖和分化等生理過程發揮重要的作用。EGFR基因突變狀態是晚期NSCLC最重要的療效預測因子和選擇治療方式的分子指標，是肺癌靶向藥物治療的靶點之一[7-8]。該文研究了肺腺癌組織中Napsin A蛋白和SP-A蛋白的表達及EGFR基因突變情況，分析其與臨床病理特征及預后的關系，以期為肺腺癌的診斷和預后提供幫助。

1 材料與方法

1.1病例資料本研究使用的216例肺腺癌組織以及同一患者手術切緣形態學正常的肺組織均為臨床診斷后剩余的標本，取自2005年～2012年于中國醫學科學院腫瘤醫院接受手術治療的原發肺腺癌患者，所有患者簽署了知情同意書，該項研究經中國醫學科學院腫瘤醫院倫理委員會批準(審批號12-098/632)。所有患者手術前未經過放療和化療，均經組織病理學診斷為肺腺癌。其中男113例，女103例；年齡32～78歲，中位年齡58.5歲。T1期29例，T2期125例，T3期38例，T4期24例。淋巴結轉移146例，淋巴結轉移情況不詳1例。腫瘤分期按照UICC第7版TNM分類標準進行，Ⅰ期48例，Ⅱ期43例，Ⅲ期109例，Ⅳ期16例。其中有完整隨訪記錄病例210例，死亡病例48例，隨訪時間1～63個月，中位隨訪時間25個月。

1.2主要試劑與儀器鼠抗人Napsin A單克隆抗體(克隆號IP64)(北京中杉金橋生物技術有限公司)；鼠抗人SP-A單克隆抗體(克隆號PE10)(福州邁新生物技術開發有限公司)；PV9000免疫組織化學檢測試劑盒及濃縮型DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)；冰凍組織DNA提取試劑盒(德國QIAGEN公司)；PCR試劑盒(日本TaKaRa公司)；PCR儀(美國ABI公司)；電泳儀(美國Bio-rad公司)；NanoDrop 2000C紫外分光光度計(美國Thermo公司)。

1.3組織微陣列制備將取得的組織標本進行常規石蠟包埋、切片和HE染色，經過顯微鏡閱片，每例針對手術切緣取2個點(正常肺組織形態)以及各區域腫瘤組織取3個點(共5個點)，并將相應組織點在蠟塊上標記。利用穿刺針將供體蠟塊轉移至受體蠟塊，制作成組織微陣列。切片厚度為4 μm。

1.4免疫組化組織微陣列切片常規脫蠟至水，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline, PBS)洗滌，3%過氧化氫封閉內源性過氧化物酶15 min，高壓抗原修復，37 ℃一抗孵育1 h，PBS洗，依次滴加PV9000免疫組化試劑盒中的聚合物輔助劑和酶標山羊抗鼠/兔IgG聚合物，37 ℃下分別孵育20 min和30 min。二氨基聯苯胺(diaminobenzidine, DAB)顯色，蘇木精復染，自來水返藍，梯度乙醇脫水，中性樹膠封片。

1.5冰凍組織基因組DNA提取從-80 ℃冰箱中取出組織，切取肺腺癌腫瘤組織及手術切緣組織各25 mg，分別置于1.5 ml的Eppendorf管中，提取基因組DNA操作流程按QIAamp DNA Mini試劑盒(Cat No.51304)說明書進行。

1.6EGFR基因目的片段PCR擴增及測序使用NanoDrop 2000C紫外分光光度計檢測基因組DNA的質量和濃度，并用無DNase水稀釋至20 ng/μl作為模版。PCR擴增反應體系：10×PCR緩沖液2 μl，dNTP混合液(2.5 mmol/L)1.6 μl，引物(10 μmol/L)1 μl，模板DNA(20 ng/μl)1 μl，rTaq DNA聚合酶0.2 μl，去離子水14.2 μl。反應條件為：98 ℃預變性5 min；98 ℃變性10 s，60 ℃退火5 s，72 ℃延伸50 s，30個循環；最后72 ℃延伸8 min。EGFR基因19外顯子引物序列：F：5′-GCAATATCAGCCTTAGGTGCGGCTC-3′，R：5′-CATAGAAAGTGAACATTTAGGATGTG-3′；EGFR基因21外顯子引物序列：F：5′-CTAACGTTCGCCAGCCATAAGTCC-3′，R：5′-GCTGCGAGCTCACCCAGAATGTCTGG-3′。引物由北京天一輝遠生物技術有限公司合成。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，送至北京天一輝遠生物技術有限公司進行測序。

1.7免疫組化結果及基因突變結果判斷參照相應文獻[9]及目前比較成熟的美國FDA推薦的免疫組化結果評分系統(Dako, HercepTestTMInterpretation Manual)，制定評分標準。免疫組織化學染色以細胞質或細胞膜出現棕色狀染色為陽性，對陽性細胞染色強度和陽性細胞百分比進行評分。按染色強度評分：無染色0分，淺棕色1分，中度著色2分，深棕色3分。按陽性細胞百分比評分：陽性細胞百分比<10%為1分，10%≤陽性細胞百分比<50%為2分，50%≤陽性細胞百分比<80%為3分，陽性細胞百分比≥80%為4分。根據陽性細胞染色強度和陽性細胞百分比評分之積進行總體評分。每例3個區域腫瘤位點分別進行評分，取3個腫瘤位點的平均分為最終評分。最終評分<1分為陰性，≥1分定義為陽性。EGFR基因突變的判斷，使用BioEdit軟件讀取序列圖譜和堿基序列。癌組織和配對的手術切緣組織序列進行對比，并將結果在NCBI網站進行BLAST對比，最終確定標本中EGFR基因是否突變。

1.8統計學處理采用軟件SPSS 23.0進行統計學分析。計數資料采用χ2檢驗、配對χ2檢驗，采用Kaplan-Meier方法分析Napsin A蛋白和SP-A蛋白表達情況與患者術后總生存之間的關系，并通過Cox比例風險模型分析不同臨床病理參數和Napsin A、SP-A蛋白表達情況對肺腺癌患者術后生存時間的影響。檢驗水準為α=0.05。

2 結果

2.1NapsinA蛋白在肺腺癌組織中的表達與臨床病理特征的關系免疫組化結果顯示，Napsin A蛋白在腫瘤組織中陽性表達位于細胞質和細胞膜，陽性率為74.5%(161/216)；手術切緣肺組織中，陽性表達位于肺泡Ⅱ型上皮細胞的細胞膜和細胞質(圖1)。Napsin A蛋白表達情況與肺腺癌患者的年齡、T分期、淋巴結轉移等臨床病理特征無統計學相關性(表1)。

2.2SP-A蛋白在肺腺癌組織中的表達與臨床病理特征的關系免疫組化結果顯示，SP-A蛋白在腫瘤組織中陽性表達位于細胞質和細胞膜，陽性率為34.3%(74/216)，在手術切緣組織中不表達(圖2)。SP-A蛋白表達與肺腺癌患者的年齡、T分期、淋巴結轉移等臨床病理特征無統計學相關性(表1)。

圖1 Napsin A蛋白在肺腺癌組織和手術切緣組織的表達 ×200

A：手術切緣組織中Ⅱ型肺泡細胞中等陽性；B：癌組織弱陽性；C：癌組織中等陽性；D：癌組織強陽性

2.3NapsinA和SP-A蛋白與肺腺癌患者預后的相關性Kaplan-Meier生存分析顯示，Napsin A蛋白陽性的肺腺癌患者生存時間長于Napsin A蛋白陰性患者(P=0.003)(圖3)，SP-A蛋白表達情況與術后生存時間無統計學相關性。Cox多因素回歸分析顯示，Napsin A蛋白表達是肺腺癌患者預后良好的一個獨立預測因素(P=0.002)，見表2。

圖2 SP-A蛋白在肺腺癌組織和手術切緣組織的表達 ×200

A：手術切緣組織中陰性；B：癌組織弱陽性；C：癌組織中等陽性；D：癌組織強陽性

圖3 Napsin A蛋白表達與肺腺癌患者術后生存時間的關系

臨床病理指標nNapsin A蛋白陽性例數陰性例數χ2值P值SP-A蛋白陽性例數陰性例數χ2值P值年齡(歲) ≥6010076240.2100.64732680.4220.516 <6011685314274性別 男11379342.6710.10236770.6060.436 女10382213865吸煙情況 是8865230.0350.43629590.1120.738 否12896324583T分期 T1～T2154119352.1160.146541000.1550.694 T3～T46242202042淋巴轉移 有147110370.0210.88550970.0120.912 無6951182445臨床分期 Ⅰ～Ⅲ199146531.1250.289651342.8590.091 Ⅳ1715298

表2 肺腺癌患者術后生存時間的Cox回歸分析

圖4 肺腺癌組織中EGFR基因19外顯子和21外顯子野生型與突變型序列峰圖

2.4EGFR基因突變情況與肺腺癌患者臨床病理特征的關系45例肺腺癌組織EGFR基因突變率為31.1%(14/45)，其中19外顯子突變率為16.3%(7/43)，均為缺失突變。21外顯子突變率為17.8%(8/45)，均為L858R點突變(圖4)。沒有19外顯子與21外顯子同時發生突變的病例。EGFR基因突變與肺腺癌患者的年齡、T分期和淋巴結轉移情況等臨床病理特征無統計學相關性(表3)。

2.5肺腺癌組織中NapsinA和SP-A蛋白的表達、EGFR基因突變的相關性Napsin A蛋白在腫瘤組織中的陽性率為74.5%(161/216)，SP-A蛋白在腫瘤組織的陽性率34.3%(74/216)。Napsin A蛋白在肺腺癌中的陽性率高于SP-A蛋白，差異有統計學意義(P<0.001)，見表4。Napsin A蛋白表達陽性者，SP-A蛋白的陽性率為42.9%(69/161)；Napsin A蛋白表達陰性者，SP-A蛋白的陽性率為9.1%(5/55)。

表3 EGFR基因突變情況與肺腺癌患者臨床病理特征的關系(n)

表4 Napsin A、SP-A蛋白陽性率分析(n)

Napsin A蛋白陽性者EGFR基因突變率為41.7%(15/36)，Napsin A蛋白陰性者，沒有病例發生EGFR基因突變。SP-A蛋白陽性者EGFR基因突變率為33.3%(5/15)，SP-A蛋白陰性者EGFR基因突變率為33.3%(10/30)，差異無統計學意義。Napsin A蛋白表達陽性病例EGFR基因突變率較表達陰性病例突變率高，差異有統計學意義(P=0.020)，見表5。

表5 Napsin A、SP-A蛋白的表達與EGFR突變的相關性(n)

*Fisher精確檢驗

3 討論

EGFR突變主要發生于18～21外顯子，其中19外顯子缺失突變和21外顯子點突變是最常見的[13-14]。該研究中EGFR基因突變的患者，Napsin A蛋白表達均為陽性。盡管該相關性還需擴大樣本量進一步驗證，但作為一個重要提示，對Napsin A蛋白陽性的患者可進行EGFR基因突變的檢測，為應用EGFR靶向藥物進行個體化治療提供依據，以期提高肺癌患者的生存質量。

目前在肺癌的早期診斷方面并沒有很理想的方法，肺癌的惡性程度高，腫瘤進展迅速。有文獻[15]報道，肺癌確診時已有40%的患者發生遠處轉移，錯過了最佳的手術時機。肺癌的治療方法有手術、放療、化療及靶向藥物治療等。肺癌患者臨床診療中首先要確定肺癌的亞型分類，才能采取相應的治療方法。免疫組化技術和基因檢測技術常用來確定腫瘤的亞型和分子分型。該研究結果提示，Napsin A蛋白陽性表達有助于肺腺癌亞型的診斷，Napsin A蛋白陽性表達的肺腺癌患者其預后較好。而且，Napsin A蛋白陽性患者檢測出EGFR基因突變的概率較高，有可能應用于基于EGFR基因突變的肺癌靶向治療。