AMPK磷酸化在異煙肼致肝損傷中的作用

劉瑞雪，魯桓兵，宋育林

結核病目前仍然是全球災難性疾病之一，在結核病臨床防治過程中，異煙肼(isoniazid，INH)是一線抗結核藥；異煙肼的使用會產生不良反應，主要是抗結核藥物性肝損傷(antituberculosis drug-induced liver injury，ADLI)，嚴重者可使治療中斷或失敗，甚至造成肝衰竭或死亡[1]。異煙肼所致肝損傷涉及多種機制，可能與代謝產物的直接毒性作用、基因多態性、氧化應激反應、線粒體功能障礙、免疫反應、肝細胞轉運體異常等因素相關[2]，確切機制目前仍不明確。AMP依賴的蛋白激酶[adenosine 5′-monophosphate(AMP)-activated protein kinase,AMPK]參與多種機制調節，在脂質代謝上，AMPK通過調節自身磷酸化參與脂質合成和分解代謝，磷酸化AMPK通過修飾乙酰輔酶羧化酶(acetyl CoA carboxylase, ACC)磷酸化而抑制酶的活性，抑制脂肪酸合成，減少脂質積累[3]。Foretz et al[4]研究證明AMPK磷酸化可抑制脂肪酸合成酶(fatty acid synthase, FAS)，引起脂肪酸合成減少。異煙肼所致肝損傷的病理表現有脂肪變性，炎細胞浸潤等。該研究通過建立異煙肼所致肝損傷大鼠模型，探討AMPK磷酸化在異煙肼所致肝損傷中的作用。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1動物 健康SD大鼠，SPF級，雄性，體質量120～150 g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司。

1.1.2藥品與試劑 異煙肼購自美國Sigma公司；生理鹽水購自中國大冢制藥公司；總膽固醇(total cholesterol，TC)、三酰甘油(triglycerides，TG)試劑盒購自南京建成生物工程研究所；肝組織TG試劑盒購自北京普利來公司；AMPK、p-AMPK、p-ACC一抗購自美國Cell Signaling公司；FAS、GAPDH一抗、辣根酶標記山羊抗兔IgG二抗購自美國Santa Cruz公司。

1.1.3主要儀器 DPP全自動生化分析儀(瑞士RocheModular公司)；光學顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；酶標儀(美國Thermo公司)。

1.2實驗方法

1.2.1分組 按照隨機數字表法將24只大鼠隨機分為3組:正常對照組、異煙肼低劑量組、異煙肼高劑量組，每組8只。所有大鼠進行標準化飼養，自由進食，飼養環境溫度 (20±2)℃，室內濕度保持在 50%～70 %，晝夜節律保持 12 h 光照與 12 h 黑暗交替。每3 d稱重一次，適應性飼養1周。

1.2.2給藥 參考文獻[5]方法及本課題組前期實驗基礎，異煙肼組給予 50 mg/(kg·d)異煙肼及100 mg/(kg·d)，正常對照組給予等劑量生理鹽水，均每日定時灌胃一次，共2周。

1.2.3取材 給藥2周后處死大鼠。取材前禁食、水12 h， 水合氯醛300 mg/kg麻醉后腹主動脈采血，收集血清，留取肝左葉，用10%福爾馬林緩沖液固定，余肝臟組織凍存于液氮中，隨后轉移至-80 ℃冰箱儲存待測。

1.3觀測指標及測定方法

1.3.1肝指數測定及形態學觀察 稱重后處死大鼠，低溫下完整迅速取肝，稱重，計算肝指數(肝指數=肝重/體重)，取部分肝左葉組織，10%中性福爾馬林組織液固定，常規脫水，石蠟包埋，切片及HE染色。光學顯微鏡下觀察肝組織形態學結構。

1.3.2血清肝功能指標 全自動生化分析儀測定大鼠血清谷丙轉氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、谷草轉氨酶(aspartate transaminase，AST)總膽紅素(total bilirubin，TBIL)、直接膽紅素(direct bilirubin，DBIL)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)及總膽汁酸(total bile acid，TBA)水平。

1.3.3血清血脂指標 使用試劑盒于酶標儀測定大鼠血清TG、TC水平。

1.3.4肝組織血脂指標 使用試劑盒于酶標儀測定大鼠肝臟組織TG水平。

1.3.5肝臟組織p-ACC免疫組織化學染色 按照VP-6001二步法免疫組織化學試劑說明書進行，一抗濃度為1 ∶400，用PBS代替一抗作為陰性參照，DAB顯色，蘇木精復染，中性樹脂封片。陽性結果判定標準：肝細胞的胞質內出現棕黃色為陽性細胞，每例在光鏡下隨機挑選5個高倍視野(×400)，每個視野取5個視場，每個視場面積為268 μm2，采用Image plus 6.0高清晰圖像分析系統進行分析切片，測定肝組織p-ACC染色的平均光密度(optical density，OD)值。

1.3.6Western blot測定 AMPK、p-AMPK、FAS蛋白表達 提取大鼠肝蛋白，10%SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，轉膜，5%脫脂牛奶封閉1 h后，分別加AMPK及p-AMPK(1 ∶1 000)、FAS(1∶100)、DAPDH(1∶200)一抗，于4 ℃孵育過夜，TBST洗膜，相應的二抗(1∶5 000)室溫孵育，TBST洗膜，化學發光法檢測熒光信號。采用Image J高清晰圖像分析系統進行分析，測定肝組織p-AMPK、AMPK、FAS、GAPDH表達的灰度值。

2 結果

2.1一般情況與正常對照組比較，異煙肼組大鼠毛發光澤減弱，尤以高劑量組明顯，活動度一般，體重增長幅度較小。與正常對照組比較，異煙肼組在進入實驗第6天體重增加幅度下降。異煙肼組大鼠在實驗第6天(F=4.259，P<0.05)、第9天(F=4.782，P<0.05)、第12天(F=4.882，P<0.05)及實驗結束時(F=6.281，P<0.001)低于正常對照組。見圖1。

圖1 各組大鼠體重增長曲線

2.2肝指數異煙肼低劑量組、異煙肼高劑量組大鼠肝指數分別為(0.032±0.002)和(0.037±0.001)，均較正常對照組肝指數(0.031±0.001)增加，且異煙肼高劑量組與正常對照組相比差異有統計學意義(F=34.444，P<0.01)。

2.3血清肝生化變化異煙肼高劑量組ALT、AST分別較正常對照組顯著增加(P<0.01)。異煙肼高劑量組血清TG較正常對照組顯著增加(P<0.05)。見表1。

2.4肝組織TG生化變化異煙肼高劑量組肝組織TG為(16.674±1.697)mg/g 肝重量，高于正常對照組(12.015±1.739 )mg/g 肝重量和異煙肼低劑量組(13.815±2.298)mg/g 肝重量，差異有統計學意義(F=11.845,P<0.001)。

2.5肝臟病理學改變光鏡下，正常對照組大鼠肝小葉結構完整，肝細胞大小及形態正常。異煙肼組大鼠肝細胞可見脂肪變性，部分存在點狀肝細胞壞死、炎性細胞浸潤，其中異煙肼高劑量脂肪變性更明顯。見圖 2。

2.6肝臟p-ACC表達情況免疫組織化學染色結果顯示，正常對照組肝細胞質中有p-ACC表達的黃色顆粒。與正常對照組比較，異煙肼組p-ACC表達的強度和范圍減少，且異煙肼高劑量組更明顯。與正常對照組OD值(0.226±0.023)比較，異煙肼低劑量組(0.187±0.008)和異煙肼高劑量組(0.180±0.008)p-ACC的OD值均明顯低于正常對照組(F=10.932，P<0.001)。見圖3。

2.7肝組織AMPK及p-AMPK、FAS蛋白表達情況與正常對照組比較，異煙肼組AMPK表達均無明顯差異。低劑量、高劑量異煙肼組p-AMPK/AMPK灰度比值分別為(0.164±0.004)、(0.155±0.004)，均低于正常對照組(0.880±0.015)，差異有統計學意義(F=5 715.645，P<0.001)，提示表達明顯減少。異煙肼低劑量、高劑量組FAS灰度分別為(0.639±0.038)、(1.230±0.044)，高于正常對照組 (0.187±0.007)，提示表達增加，差異有統計學意義(F=718.268，P<0.001)。見圖4。

表1 各組大鼠肝指數及血清生化指標

與正常對照組比較：*P<0.05，**P<0.01

圖2 各組大鼠肝臟病理學變化 HE×400

圖3 各組大鼠肝臟p-ACC的表達情況 免疫組化×400

圖4 Western blot法檢測肝組織AMPK、p-AMPK和FAS表達情況

A：p-AMPK表達；B：FAS表達；1：正常對照組；2：異煙肼低劑量組；3：異煙肼高劑量組；與正常對照組比較：***P<0.001

3 討論

本實驗結果表明，異煙肼處理2周可導致大鼠肝細胞脂肪變性，部分存在點狀肝細胞壞死、炎癥細胞浸潤。與文獻[5]報道一致。結果顯示，異煙肼組的大鼠血清ALT、AST高于正常對照組，異煙肼組的肝形態學改變，且高劑量組表現嚴重，表明本研究建立異煙肼致肝損傷模型成功。本研究中，肝臟組織及血清中TG含量均增加，且高劑量組與正常對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)，提示異煙肼可引起肝細胞內TG含量增加造成肝細胞脂肪變性。

肝細胞脂肪變性的發生與脂肪酸的攝取、合成及氧化障礙有關。AMPK是一種應激敏感性激酶，激活AMPK可通過促進糖酵解和脂肪酸氧化；引起ACC磷酸化增加，抑制ACC活性；抑制FAS表達減少，引起脂肪酸合成減少[3-4,6-8]；還可通過上調過氧化物酶體增殖物激活受體 α(PPARα) 來促進脂肪分解[9]。因而，在肝臟脂質穩態調節中發揮重要作用。研究[6-8]表明，AMPK磷酸化的抑制參與了非酒精性脂肪肝和酒精性脂肪肝的發病過程。研究[10]顯示，給予AMPK敲除的小鼠高脂飼料喂養，第5周時即出現肝脂肪變，血糖升高及胰島素抵抗；而正常組小鼠第12周時才出現肝脂肪變。本研究結果顯示，異煙肼處理2周后大鼠肝臟AMPK磷酸化水平顯著下降，伴隨著ACC磷酸化水平的減低，即ACC活性增加和FAS表達的增加，提示AMPK磷酸化下降及其下游參與脂肪酸合成的ACC及FAS增加參與了異煙肼所致的大鼠肝損傷的病理過程。

AMPK是一種重要的能量穩態傳感器，參與細胞能量水平和代謝壓力的調節，具有較為復雜的活性調節機制，在肝組織中，AMPKα1為最常見的催化亞基，受TGF-β活化激酶-1、肝激酶B1以及鈣調蛋白依賴性蛋白激酶(calmodulin- dependent protein kinasekinase，CaMKK)3種激酶調節，負責活化磷酸化基團，生理AMP/ADP增加的細胞應激，如低氧、饑餓或葡萄糖剝奪，也可激活AMPK磷酸化[6,11]。異煙肼抑制肝臟AMPK磷酸化的可能機制：① 異煙肼在體內代謝為乙酰肼和肼，異煙肼在肝內經P-450還原后，產生親電子基、自由基、氧基等毒性代謝產物，破壞肝細胞膜的完整性和膜的Ca2+-ATP酶系，使細胞內外環境Ca2+的穩態被破壞，肝化學毒性損害時通過Ca2+濃度下降并抑制相關酶形成，如AMPK磷酸化上游激酶，CaMKK-β，抑制AMPK磷酸化[10,12-13]；② SIRT1-AMPK通路的抑制作用：前期研究[14]顯示，異煙肼和利福平合用減少肝臟SIRT1表達。文獻[15]報道，激活SIRT1/AMPK通路可以減輕肝損傷，提示異煙肼可能會通過SIRT1/AMPK通路抑制AMPK磷酸化，但確切機制尚有待探討。

本研究表明，異煙肼可通過抑制AMPK磷酸化，抑制ACC磷酸化，上調FAS表達，造成肝細胞內TG沉積，導致肝細胞脂肪變性。提示AMPK磷酸化有可能成為防治異煙肼所致肝損傷的脂肪變性的一個治療靶點。