清氣化痰湯對哮喘小鼠肺組織TLR4和MUC5AC表達影響

陳 竹, 彭 玉,陶 瓊, 吳 敏, 羅貞清，李圣鉆

支氣管哮喘(簡稱哮喘)是全球威脅公眾健康的常見慢性呼吸道疾病，其發病率呈逐年增高趨勢[1]。兒童是哮喘的高發人群，近年來我國0～14歲兒童哮喘患病率平均為3.02%，較十年前增加了53.3%[2]。迄今哮喘的發病機制仍未完全明確，哮喘發作時痰液易生難消，成為中西醫治療中的難點。清氣化痰湯臨床運用能有效緩解痰熱壅肺所致咳嗽、痰鳴諸癥。前期的研究[3]證實該方能抑制炎癥介質的釋放，減少肺組織中炎性滲出，減輕肺組織損傷，但減少哮喘痰液生成的具體機制不明確。基于TLRs在哮喘的發生發展中起著較為重要的作用[4]，該實驗通過對小鼠血清和支氣管肺泡灌洗液(broncho alveolar lavage fluid,BALF)中多種炎性介質的檢測、肺組織中TLR4基因和蛋白表達、黏蛋白MUC5AC基因和蛋白的表達觀察，探討清氣化痰湯對哮喘模型小鼠氣道黏液高分泌表達的干預機制，為臨床運用清氣化痰湯治療小兒哮喘提供依據。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 BALB/c小鼠，雌性，4～6周齡，SPF級，合格證號SYXK(黔)2012-001，購自貴州省實驗動物工程中心。

1.1.2清氣化痰湯制備 清氣化痰湯由膽南星、全瓜蔞、法夏、浙貝、枳殼、陳皮、茯苓、杏仁等10味中藥組成，用該方540 g克加水900 ml 煎煮，濾出藥液，藥渣加500 ml再煎煮濾出，合并兩次濾液濃縮至100 ml。

1.1.3試劑和試劑盒 2% Aluminium Hydroxide Gel Adjuvant購自美國Invivogen公司(Lot #5113)；卵清白蛋白(albumin from chicken egg white, OVA)購自美國Sigma公司(批號1001988500)；注射用地塞米松磷酸鈉購自馬鞍山豐原制藥有限公司(批號150512-1)；小鼠腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α，TNF-α)(JEM-12)、白介素(interleukin，IL)-4(JEM-04)和IL-5(JEM-03)定量分析酶聯免疫檢測試劑盒購自安徽巧伊生物科技有限公司；小鼠IL-13定量分析酶聯免疫檢測試劑盒購自聯科生物科技有限公司(221341235)；動物組織總RNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司(#03901)；Prime ScriptTMRT reagent Kit 和SYBR Premix Ex TaqTMⅡ購自日本TaKaRa公司；兔抗TLR4多克隆抗體(BA1717)、兔抗MUC5AC多克隆抗體(BA3293)購自武漢博士德生物工程有限公司；GTVisionⅢ抗鼠/兔通用型免疫組化檢測試劑盒購自基因科技(上海)有限公司(批號2015121601)。

1.2方法

1.2.1哮喘小鼠模型的建立及實驗分組 根據文獻[5]的方法并予以改進建立哮喘模型：第1、8、15天腹腔注射OVA及氫氧化鋁凝膠混合液0.2 ml(內含OVA 60 μg及2.25 mg氫氧化鋁凝膠)致敏；第21天開始用5%OVA溶液8 ml行超聲霧化，每次30 min，連續霧化5 d進行激發。實驗分組，45只小鼠分為5組，每組9只：① 正常組(CON組)，用生理鹽水代替OVA進行致敏和霧化，不給藥；② 哮喘組( MOD組)，按上述方法進行致敏和激發，不給藥；③ 地塞米松組(TRE組)，按上述方法進行致敏和激發，于每次激發前30 min腹腔注射地塞米松(0.5 mg/kg)；④ 清氣化痰湯治療組(X1組)，按上述方法進行致敏和激發，于每次激發前30 min灌胃給予清氣化痰湯0.01 ml/g；⑤ 清氣化痰湯和地塞米松聯合治療組(X2組)，按上述方法進行致敏和激發，于每次激發前30 min灌胃給予清氣化痰湯0.01 ml/g，腹腔注射地塞米松(0.25 mg/kg)。于治療后第6天處死小鼠3只/組，分別稱小鼠體重和肺組織重量并記錄；同時摘眼球取血并制備血清凍存于-20 ℃；從氣管注射無菌生理鹽水 0.5 ml入肺，抽吸3次后將抽出液體即BALF凍存于-20 ℃；取右下肺葉置于4%多聚甲醛中固定；余下肺組織凍存于-80 ℃。各組小鼠不再激發，隔天給予相應藥物1次，持續5次后，處死小鼠，留存標本及相應檢查同前。

1.2.2肺組織TLR4和MUC5AC mRNA的檢測 采用Real-time PCR法，TLR4上游引物：5′-CAGCAAAGTCCCTGATGACA-3′；下游引物：5′-AGAGGTGGTGTAAGCCATGC-3′；MUC5AC上游引物：5′-ACACCGCTCTGATGTTCCTCACC-3′；下游引物：5′-ATGTCCTGGGTTGAAGGCTCGT-3′；GAPDH上游引物：5′-CATGGCCTTCCGTGTTCCTA-3′；下游引物：5′-GCGGCACGTCAGATCCA-3′。每個樣品各取約20 mg肺組織，參照說明書提取總RNA，逆轉錄合成cDNA。以2 μl cDNA為模板行Real-time PCR檢測。反應條件：預變性(95 ℃，30 s)，PCR反應(40個循環，95 ℃，5 s；52 ℃，30 s)。確定Real-time PCR的擴增曲線和融解曲線，記錄各組的Ct值。分別以GDPDH為內參，計算各組樣本中MUC5AC、TLR4基因的表達量，并對表達量的比值(2-ΔΔCt)進行分析。

1.2.3肺組織TLR4和MUC5AC蛋白的檢測 常規方法制備肺組織石蠟切片，采用免疫組化SP法進行操作。陽性部位成棕褐色。采用Image-Pro Plus圖像分析軟件進行圖像分析，取平均積分光密度值表示目的蛋白的表達水平。

1.2.4血清及BALF中TNF-α、IL-4、IL-5和IL-13因子的含量檢測 根據試劑盒說明書方法進行，根據檢測結果繪制標準曲線，計算各樣品中指標因子的含量，制作柱形圖。

2 結果

2.1小鼠肺組織TLR4和MUC5ACmRNA的表達qRT-PCR的結果顯示，MOD組肺組織TLR4基因在治療第5天或15天時較CON組上調，而治療TRE組、X1組和X2組可下調TLR4基因的表達；MOD組肺組織MUC5AC 基因表達在治療第5天或15天時均明顯增高，治療TRE組、X1組和X2組可下調MUC5AC基因的表達，見圖1。

圖1 清氣化痰湯對哮喘小鼠肺組織TLR4和MUC5AC mRNA表達的影響

2.2小鼠肺組織TLR4和MUC5AC蛋白的表達TLR4蛋白表達在上皮細胞表面，MUC5AC蛋白主要表達在支氣管上皮細胞，存在于胞質內，陽性染色表現為棕褐色顆粒。治療5 d或15 d后，MOD組肺組織TLR4蛋白表達強于TRE組、X1組和X2組，以TRE組和X2組顯著(P<0.01)(圖2)；MOD組肺組織MUC5AC 蛋白表達明顯高于CON組，而TRE組、X1組和X2組肺組織這兩種蛋白的表達均下調，以TRE組和X2組下調顯著(P<0.01)(圖3)。

圖2 清氣化痰湯對哮喘小鼠肺組織TLR4蛋白表達的影響 ×200

圖3 清氣化痰湯對哮喘小鼠肺組織MUC5AC蛋白表達的影響 ×200

2.3小鼠血清中TNF-α、IL-4、IL-5和IL-13因子的含量在治療后第5天和第15天時，MOD組血清的TNF-α、IL-4、IL-5和IL-13因子的含量均顯著高于CON組，TRE組和X2組的血清的TNF-α、IL-4、IL-5和IL-13因子的含量顯著下調，單獨應用清氣化痰湯的X1組血清的TNF-α、IL-4、IL-5亦較MOD組的含量降低(P<0.05)。以上下調作用以清氣化痰湯和地塞米松聯用的X2組更為顯著(P<0.01)(圖4)。

2.4小鼠BALF中TNF-α、IL-4、IL-5和IL-13因子的含量在治療后第5天和第15天時，MOD組BALF中的TNF-α、IL-4、IL-5和IL-13因子的含量均較CON組明顯增高，TRE組和X2組的血清的TNF-α、IL-4、IL-5和IL-13因子的含量下調，單獨應用清氣化痰湯的X1組血清的IL-5和IL-13亦較MOD組的含量降低(P<0.05)。以上下調作用以清氣化痰湯和地塞米松聯用的X2組更為顯著(P<0.01)(圖5)。

圖4 清氣化痰湯對哮喘小鼠血清中的TNF-α、IL-4、IL-5和IL-13因子含量的影響

圖5 清氣化痰湯對哮喘小鼠BALF中的TNF-α、IL-4、IL-5和IL-13因子含量的影響

3 討論

支氣管哮喘，是一種以慢性氣道炎癥和氣道高反應性為特征的異質性疾病[6]，氣道黏液高分泌是其重要的病理特征。氣道黏液(mucus)由氣道杯狀細胞和黏膜下腺體分泌細胞生成，杯狀細胞是產生黏液的重要細胞，它將粘蛋白快速分泌到氣道的表面，使氣道內持續過度分泌黏液，導致并加重呼吸道氣流阻塞，加速肺功能下降。同時，氣道儲留的黏液為細菌生長提供了良好培養基，易導致呼吸道感染的發生并難以控制[7]。MUC5AC是由杯狀細胞產生，氣道上皮MUC5AC蛋白的含量和MUC5AC mRNA代表氣道黏液分泌的程度。研究顯示哮喘氣道杯狀細胞增生明顯，同時肺組織中的MUC5AC蛋白的含量和MUC5AC mRNA也明顯升高，MUC5AC被認為是哮喘氣道杯狀細胞增生和分泌亢進的主要標志，是影響哮喘病情發展及其預后的獨立危險因素[8-9]。

TLRs介導天然免疫并連接獲得性免疫，TLRs 基因多態性與哮喘個體的易感性和嚴重程度密切相關[10]，往往決定了個體對過敏原的敏感性[11]。TLRs在氣道炎癥的調節中有重要意義，其中TLR4承擔了重要作用。實驗證明，TLR4主要分布在氣道上皮細胞、肺泡巨噬細胞等[12]，能激發一系列信號通路，促進炎癥的發生及加重[13]。研究[14]顯示，TLR4 基因多態性特征中TLR4/TRIF信號通路可激活NF-κB，導致炎癥因子如TNF-α、IL-4、IL-6等炎癥因子增加，上調粘蛋白基因轉錄或刺激氣道上皮杯狀細胞和黏膜下腺體細胞增生，使氣道黏液分泌增加，并引起嚴重的氣道炎癥和氣道重塑。

痰易生難消是目前治療哮喘的一個難點，中醫認為痰伏儲于氣道是哮喘發生和加重的病理基礎。結合現代醫學對哮喘因病機的認識，推測哮喘“痰飲伏肺”的中醫病理特征與現代醫學哮喘氣道炎癥、氣道黏液高分泌表達存在必然的聯系。本實驗結果顯示，清氣化痰湯可在基因和蛋白水平下調TLR4的表達，使血清和BALF中的促炎因子TNF-α、IL-4、IL-5和IL-13的含量均下調，提示清氣化痰湯可通過調節TLR4的表達,干預哮喘小鼠的免疫應答，繼而影響炎癥因子的釋放，減輕哮喘小鼠氣道炎癥反應。

同時，研究顯示MOD組肺組織TLR4、MUC5AC基因及蛋白的表達水平在治療第5天或第15天時較CON組上調，且隨哮喘時間延長而顯著增加，說明哮喘時氣道黏液存在高分泌，與文獻[15]報道一致，這與中醫認為“夙痰伏于肺，遇觸即發”的病機有一致性。治療TRE組、X1組和X2組可下調MUC5AC基因的表達，說明清氣化痰湯可通過下調肺組織MUC5AC的基因和蛋白表達，緩解氣道黏液高分泌。

本研究結果表明，清氣化痰湯可能通過TLR4/ TRIF信號通路抑制NF-κB，下調TLR4和MUC5AC的表達以拮抗哮喘氣道炎癥反應、減輕氣道黏液高分泌，從而有效緩解哮喘發作時痰液壅盛所致的痰多、咳嗽、喘息等癥。但研究顯示清氣化痰湯不論是在干預炎癥因子的釋放還是在減輕氣道黏液高分泌方面與地塞米松聯用時具有協同作用，其作用機制需進一步研究。

名老中醫藥專家學術思想和臨床經驗是我國傳統醫學的精髓，也是現代中醫文化傳承的重要內容。很多名老中醫經驗方的臨床療效確切，但由于其作用機制未闡明，限制和束縛了臨床的廣泛運用。探討清氣化痰湯多途徑、多環節、多靶點的治療作用，研究其在減少氣道黏液生成，減輕氣道重塑的作用機制，不僅為名老中醫經驗方的臨床應用提供理論依據，也為治療兒童哮喘提供了新的治療思路和手段。