地塞米松對前列腺癌PC3細胞自噬的影響

王培宇，梁前俊，張 力,2，樊 松,2，梁朝朝,2

前列腺癌是老年男性常見的惡性腫瘤，隨著前列腺特異性抗原(prostate specific antigen,PSA)篩查的普及，更多的患者被早期檢出。然而一部分患者就診時已經為臨床晚期，治療方法上常采用內分泌聯合放療或根治性手術[1]。自噬是細胞內溶酶體降解過程，在細胞生長、分化和內環境穩態中起著重要作用，參與細胞器的更新和細胞正常代謝。糖皮質激素可以誘導骨細胞的自噬[2]，也可以降低去勢抵抗型前列腺癌患者的PSA水平，其中地塞米松(dexamethasone，Dex)可能是單一療法中效果最好的糖皮質激素[3]。目前糖皮質激素對前列腺癌自噬的影響尚不十分清楚，該研究使用不同濃度的糖皮質激素Dex處理激素非依賴性前列腺癌PC3細胞，觀察自噬過程的變化，并通過自噬抑制劑氯喹(chloroquine,CQ)來探討自噬對Dex作用下前列腺癌PC3細胞的影響，為晚期激素非依賴性前列腺癌患者的治療提供參考依據。

1 材料與方法

1.1主要實驗材料和儀器前列腺癌PC3細胞來自安徽醫科大學第一附屬醫院泌尿外科研究所；Dex購自山東辰欣藥業股份有限公司；CQ購自美國Selleck公司；LC3質粒標記綠色熒光蛋白轉染質粒(greenefluorescent-LC3,GFP-LC3)和Lipofectamine 2000轉染試劑購自美國 Invitrogeng公司；MTT購自美國Solarbio公司；兔抗LC-3抗體、鼠抗GAPDH抗體、兔鼠二抗購自武漢伊萊瑞特生物科技有限公司；細胞培養試劑購自美國Gibco公司；超凈工作臺購自蘇州凈化設備公司；高速冷凍離心機購自美國Thermo公司； Chemiscope 5600 化學發光成像系統購自上海勤翔科學儀器有限公司;ELx800酶標儀購自美國伯騰儀器有限公司。

1.2方法

1.2.1MTT實驗 PC3細胞培養在1640培養基，含10%胎牛血清和0.1%青霉素、鏈霉素。在37 ℃、5%CO2的培養箱中生長。細胞接種于96孔板，細胞貼壁24 h后分別以Dex(0、500、750、1 000 μmol/L)以及50 μmol/L CQ處理24 h，然后每孔加入10 μl MTT溶液(5 mg/ml)，作用4 h后吸去培養液，每孔加入150 μl二甲基亞砜，溶解后490 nm下測定吸光度值。

1.2.2Western blot法檢測 不同濃度Dex(0、500、750、1 000 μmol/L)和50 μmol/L CQ處理前列腺癌PC3細胞24 h后，冰上裂解20 min,4 ℃、12 000 r/min離心10 min。取上清液加上樣緩沖液煮沸10 min,以15%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后，將LC3蛋白轉移到0.45 μm的PVDF膜上。5%的脫脂奶粉緩慢搖晃封閉2 h。1 ∶1 000稀釋LC3一抗后4 ℃孵育過夜。然后用TBST洗膜40 min，室溫下孵育二抗1 h,加ECL試劑后顯影。

1.2.3免疫熒光法 取對數生長期的PC3傳代至細胞培養皿，待細胞貼壁后按說明書將Lipofectamine 2000轉染試劑轉染GFP-LC3到PC3細胞后，以不同濃度Dex和CQ處理24 h，然后在熒光顯微鏡下觀察細胞內點狀聚集情況。

2 結果

2.1Dex對前列腺癌PC3細胞的增殖的影響與對照組比較，濃度為 500、750、1 000 μmol/L的Dex處理前列腺癌PC3細胞24 h后，MTT法測得細胞存活率相對百分比分別為(81.66%±3.47%)、(77.78%±1.15%)、(72.44%±3.42%)，差異有統計學意義(t=9.16、33.36、13.97，P<0.01)。與對照組比較，濃度為50 μmol/L CQ處理前列腺癌PC3細胞24 h后，細胞存活率相對百分比為(98.81%±0.82%),差異無統計學意義(t=2.52，P>0.05)。與不加CQ的Dex組比較，濃度為500、750、1 000 μmol/L Dex和50 μmol/L CQ共同處理細胞24 h后，細胞存活率相對百分比分別為(71.19%±2.10%)、(68.84%±3.08%)、(63.56%±3.41%)，差異有統計學意義(t=4.47、4.71、3.19，P<0.05)。見圖1。

圖1 前列腺癌PC3細胞經Dex處理后細胞存活率

與對照組比較：*P<0.01；與同濃度Dex比較：#P<0.05

2.2Dex對前列腺癌PC3細胞自噬蛋白表達的影響CQ是一種自噬抑制劑，可以升高溶酶體pH，抑制溶酶體自噬體的融合和溶酶體蛋白降解，提高LC3Ⅱ型蛋白的積累。Western blot結果顯示，在Dex作用于PC3細胞24 h后，可以觀察到LC3Ⅱ型蛋白表達增加，說明Dex誘導了前列腺癌PC3細胞的自噬效應。隨著濃度的增加，這種自噬效應更加明顯。CQ抑制了PC3細胞的自噬效應，也抑制了Dex誘導的自噬，見圖2。

2.3Dex對前列腺癌PC3細胞自噬的影響當自噬形成時，GFP-LC3 融合蛋白會轉位到自噬體膜上，在熒光顯微鏡下可以觀察到多個明亮的綠色熒光斑點。本實驗通過觀察前列腺癌PC3細胞中自噬小體GFP-LC3點狀聚集的程度來評估細胞自噬水平。Dex處理24 h后，熒光顯微鏡下觀察到Dex作用后的前列腺癌細胞內GFP-LC3點狀聚集程度較對照組增加。隨著Dex的濃度增加，GFP-LC3點狀聚集程度增加，說明Dex濃度越高，誘導自噬效應越強。CQ可以抑制前列腺癌PC3細胞的自噬，并且可以抑制Dex誘導的自噬，見圖3。

圖2 Western blot法檢測前列腺癌PC3細胞自噬蛋白LC3的表達

A：對照組；B：Dex 500 μmol/L；C: Dex 750 μmol/L；D：Dex 1 000 μmol/L；E：Dex 1 000 μmol/L+CQ 50 μmol/L；F：CQ 50 μmol/L

圖3 熒光顯微鏡下觀察前列腺癌PC3細胞中點狀GFP-LC3 ×400

A：對照組；B：Dex 500 μmol/L；C: Dex 750 μmol/L；D：Dex 1 000 μmol/L；E：Dex 1 000 μmol/L+CQ 50 μmol/L；F：CQ 50 μmol/L

3 討論

非激素依賴性前列腺癌對于常規細胞毒性藥物敏感性差，如何延長患者的生存期，提高患者的生活質量，是研究熱點之一。糖皮質激素可以減緩疾病進展，改善疼痛，降低化療的副作用，已經用于前列腺癌的藥物治療[4]。近些年，節拍化療在緩解和維持治療轉移性非激素依賴性前列腺癌展現出非常有潛力的治療價值。節拍化療具有安全、低毒性的優點，尤其適用于老年、體弱的非激素依賴性前列腺癌患者。其治療方法多樣，包括單一應用化療藥物，化療藥物聯合皮質醇類藥物以及多種化療藥物聯合應用。糖皮質激素聯合化療藥物的節拍化療方案多為Ⅱ期臨床研究，Nelius et al[5]研究了17例多西他賽耐藥的非激素依賴性前列腺癌患者，每日口服Dex 1 mg和環磷酰胺50 mg，直到疾病進展或不能耐受的副作用。9例患者治療后PSA下降，總生存期為24個月。Fontana et al[6]研究了28例激素非依賴性前列腺癌患者，其中68%為多西他賽耐藥患者。第1天，患者接受500 mg/m2環磷酰胺靜滴治療，從第2天開始，每天口服50 mg環磷酰胺聯合400 mg塞來昔布和1 mg Dex直到疾病進展。結果9例(32%)治療后PSA下降超過50%。中位無進展生存期和總生存期分別為3個月和21個月。

糖皮質激素對前列腺癌的具體作用機制目前尚不十分清楚。糖皮質激素通過負反饋抑制下丘腦、垂體軸，抑制睪丸和腎上腺雄激素的合成，延緩前列腺癌進展[7]。糖皮質激素也可以通過糖皮質激素受體依賴的方式調節細胞因子，進而抑制前列腺癌細胞的生長。通過上調轉化生長因子-β及其受體，抑制核因子κB(nuclear factor -κB，NF-κB)信號的傳導，抑制前列腺癌細胞增殖[8]。糖皮質激素可以抑制單核細胞白細胞介素-6(interleukin-6,IL-6)的表達和分泌，而IL-6參與前列腺癌細胞增殖、凋亡、遷移、侵襲[9]，通過結合其亞基gp130激活mTOR信號通路，阻止ULK 1的活化，抑制自噬小體形成， mTOR抑制劑可以減少腫瘤的血管生成和細胞增殖，因此，糖皮質激素可能通過抑制IL-6的分泌來達到抑制腫瘤的作用。國內有學者認為Dex阻滯前列腺癌DU145細胞周期于G0 / G1期，可能與其抑制了ERK1 / 2 信號通路活性以及cyclin D1 蛋白表達有關[10]。Dex抑制前列腺癌PC3細胞的機制，可能是其抑制了轉錄因子NF-κB的轉錄活性，并且抑制其下游的靶基因cyclinD1蛋白的表達[11]。

自噬是真核生物兩種主要的降解途徑之一，參與細胞的生長、增殖、分化和凋亡。在自噬過程中，一些細胞質和細胞器被自噬囊泡包被，然后遞送至溶酶體進行降解。自噬是把雙刃劍，可以去除氧化損傷的細胞器來保護細胞免受凋亡，但過度自噬也會損害細胞器。因此，自噬既可以保護細胞器和細胞成分免受氧化損傷，也可以是一個自毀的過程，導致細胞死亡[12]。自噬水平關系著細胞器的合成、降解、以及再循環利用之間的平衡[13]。Tan et al[14]評估了3種人類腫瘤細胞系(MCF7、PC3和LNCaP)對低氧的敏感性，發現自噬有助于腫瘤對抗低氧環境，因為低氧和抗癌治療的抗性有關，抑制自噬可能有助于提高腫瘤的治療效果。Kim et al[15]發現聚乙二醇化精氨酸脫亞胺酶可以誘導前列腺癌CWR22Rv1自噬和死亡，在抑制自噬后，細胞死亡增多。PC3細胞是雄激素非依賴性前列腺癌細胞，本實驗通過檢測自噬熒光蛋白GFP-LC3和自噬相關蛋白LC3的表達水平來觀察自噬，結果顯示Dex作用后自噬熒光蛋白GFP-LC3點狀聚集增多，LC3-Ⅱ型蛋白表達增加，綜合以上結果，Dex誘導了前列腺癌細胞PC3自噬。同時，本實驗顯示Dex具有抑制前列腺癌PC3細胞存活作用，在抑制了自噬效應后，Dex抑制前列腺癌PC3細胞存活作用增強，提示了Dex誘導的自噬對前列腺癌PC3細胞是保護性的，CQ作為自噬抑制劑，體現出在增強抗腫瘤藥物療效方面的潛在價值。