尿素、尿酸和總蛋白復合冰凍人血清國家標準品的研制

于 婷， 沈 敏， 孫 楠， 曲守方， 黃 杰

（1. 中國食品藥品檢定研究院非傳染病診斷試劑室 衛生部生物技術產品檢定方法及其標準化重點實驗室，北京 100050；2. 美康生物科技股份有限公司參考實驗室，浙江 寧波 315104）

血清中的尿素是人體蛋白質代謝的主要終末產物，是反映腎臟功能的重要指標之一[1-2]，并且與冠狀動脈粥樣硬化程度相關。其測定方法包括參考方法如同位素稀釋氣相色譜-質譜法，以及常規方法如脲酶法、化學方法、電極法和干化學法等[3]。血清中的尿酸含量可充分反映人體內代謝、免疫等機能的狀況，是診斷痛風、尿毒癥、糖尿病等多種疾病的重要指標之一[4-6]。其測定方法包括參考方法如同位素稀釋氣相色譜-質譜法、同位素稀釋液相色譜-質譜法[7]，以及常規方法如磷鎢酸還原法、尿酸酶-過氧化物酶偶聯法等。血清總蛋白可作為肝臟合成反應功能的重要指標之一[8]，對了解機體的營養狀況及肝臟疾病的診斷、監測及治療均有著重要的意義。其測定方法包括參考方法以及常規方法如雙縮脲終點法和雙縮脲速率法等[9-10]。

目前，臨床上使用的尿素、尿酸、總蛋白檢測試劑盒生產廠商很多，然而各廠商的校準品在基質選擇[11-12]、制備方法、量值溯源等方面都存在著一定差異，因此造成同一項目檢測結果可比性差的狀況。為了保證測量結果在時間和空間上的準確性和可比性，研制基質效應小、互通性良好、采用參考方法定值的標準品勢在必行。本研究研制了以冰凍人血清為基質的尿素、尿酸和總蛋白復合冰凍人血清國家標準品。

1 材料和方法

1.1 儀器和試劑

1.1.1 儀器 78-1磁力攪拌器（常州國華公司）；2XZ-1旋片式真空泵（臨海譚氏真空設備公司）；XS205DU電子天平，量程范圍為81 g/220 g（瑞士梅特勒公司）；Cary 100紫外可見分光光度計（美國安捷倫公司）；7180全自動生化分析儀（日本日立公司）。

1.1.2 互通性驗證用試劑 血清尿素檢測試劑盒：批號16081101，寧波美康生物公司；批號154178-01，瑞士羅氏公司；批號16-0801，北京九強公司。血清尿酸檢測試劑盒：批號16072901，寧波美康生物公司；批號148668-01，瑞士羅氏公司；批號16-0902，北京九強公司。總蛋白檢測試劑盒：批號16081502，寧波美康公司；批號k250，瑞士羅氏公司；批號16-0713，北京九強公司。

1.1.3 標準品 尿素國際標準品（批號SRM912a）、尿酸國際標準品（批號SRM913a）、總蛋白國際標準品（批號SRM927e）均購自美國國家標準與技術研究院。

1.2 方法

1.2.1 標準品的制備 收集寧波美康盛德醫學檢驗所外觀清澈透明，無溶血、黃疸、乳糜的臨床混合血清，進行人類免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒和梅毒檢測，取上述檢測結果為陰性的血清樣本合并混勻后，進行初濾、0.45 μm濾膜過濾、0.22 μm濾膜過濾。過濾裝置經高壓滅菌，并在生物安全柜中分裝于凍存管內，0.5 mL/支，于-70 ℃保存。

1.2.2 均勻性檢驗 參照CNAS-GL03《能力驗證樣品均勻性和穩定性評價指南》。在分裝的初始、中間及最終階段各抽取28支進行均勻性分析。采用精密度良好的7180全自動生化分析儀對抽取樣本進行測定，每個樣本測定3次并進行單因素方差分析。

1.2.3 穩定性實驗 短期穩定性實驗在3個溫度下進行。在第1、11、18、25、30、33、35、36、37天各取出9支樣本，分別在20～25 ℃、2～8 ℃、-20 ℃下存放3支，作為第37、27、20、13、8、5、3、2、1天的樣本，在同一天內將所有的樣本進行統一測定。采用寧波美康生物公司的總蛋白測定試劑盒（雙縮脲法）、尿素氮測定試劑盒（脲酶-谷氨酸脫氫酶法）和尿酸測定試劑盒（尿酸酶法），采用7180全自動生化分析儀對樣本進行測定。每個樣本測定3次。對所得數據進行回歸分析，利用線性回歸方差分析表來評估回歸的顯著性。-70 ℃為候選品的保存條件，進行長期穩定性的觀察，通過期間核查確認。

1.2.4 定值 采用參考方法或者經確認的方法和相應的國際標準品定值，選擇3～4家具有資質的實驗室聯合定值，具體方法見表1。定值結果采用“靶值±不確定度”表示。不確定度評估以測量不確定度表示指南（Guide to the Expression of Uncertainty in Measurement，GUM）為基礎，根據GB/T 15000.3—2008《標準樣品工作原則（3）標準樣品定值的一般原則和統計方法》[13]進行不確定度評估。不確定度的來源包括3部分，分別為：定值、均勻性以及穩定性引入的不確定度。

表1 各實驗室采用的賦值方法

1.2.5 互通性評估 依據WS/T 356—2011《基質效應與互通性評估指南》[14]進行互通性評估。評估方式：用2種測定方法（參考方法或經確認的方法、常規方法）同時對選定的25份新鮮臨床血清樣本（各濃度分布均勻）和標準品進行分析，建立2種方法測定臨床血清樣本的結果數學關系（回歸）。以評估方法測定值為Y軸，以比對方法測定值為X軸，用Origin 8.0軟件繪制散點圖及95%可信區間。采用最小二乘法進行線性擬合，采用線性回歸模型進行分析。

2 結果

2.1 均勻性檢驗結果

采用單因素方差分析方法對所得數據進行分析，結果見表2。尿素、尿酸和總蛋白的F值分別為1.071 4、1.339 9和1.275 0，均＜F0.05。

表2 候選品均勻性檢驗結果

2.2 穩定性檢驗結果

復合冰凍人血清生化國家標準品在-20 ℃條件下，尿素、尿酸和總蛋白均至少可穩定37 d；在2～8 ℃條件下，尿素可穩定27 d，尿酸及總蛋白至少可穩定37 d；在20～25 ℃條件下，尿素僅能穩定3 d，尿酸可穩定8 d，總蛋白可穩定27 d。因該國家標準品計劃保存條件為-70 ℃，故結果符合要求。在-70 ℃條件下，12個月穩定性良好，并將持續觀察長期穩定性。見表3、表4。

2.3 定值

各實驗室賦值結果變異系數均＜3.0%。見表5。

2.4 不確定度評估（以尿素為例）

2.4.1 定值結果引起的不確定度分析 候選品中尿素定值的不確定度（uchar）計算公式為：

式中s為各實驗室總的標準偏差，p為實驗室總數。計算出尿素定值的不確定度為0.08 mmol/L。

2.4.2 均勻性引入的不確定度 采用單因素方差分析方法時，均勻性的不確定度（ubb）計算公式為：

式中n0為（有效）（子）組單元數。計算出尿素均勻性的不確定度為0.02 mmol/L。

2.4.3 穩定性引入的不確定度 穩定性引入的不確定度（us）的計算公式為：

式中s（b1）為與斜率相關的不確定度，X為標準品有效期。計算出尿素穩定性的不確定度為0.022 57 mmol/L。

尿酸和總蛋白的不確定度分析同尿素。尿酸的不確定度為1.98 μmol/L，總蛋白的不確定度為1.73 g/L。

經聯合賦值及不確定度評估，每支復合冰凍人血清國家標準品的特性值分別為：尿素（5.68±0.17）mmol/L（k=2），尿酸（288.68±3.96）μmol/L（k=2），總蛋白（67.03±3.46）g/L（k=2）。

2.5 互通性評估（以尿素為例）

對參考方法和3個不同檢測系統進行25份血清樣本的直線相關與回歸分析，以參考方法測定值為X軸（對照），待評方法測定值為Y軸，進行線性回歸分析，候選品中尿素濃度均在回歸直線95%可信區間范圍內，見圖1。按照同樣方法分析候選品中的尿酸和總蛋白，其在3個檢測系統上均無基質效應。

表3 短期穩定性測定結果

表4 12個月穩定性測定結果

表5 各實驗室賦值結果匯總

圖1 尿素候選品在3個檢測系統上的基質效應評價

3 討論

體外診斷試劑標準品是實現檢測結果準確一致的重要組成部分，也是保證量值有效傳遞的計量實物標準。均勻性、穩定性和定值準確是標準品的主要特征。考慮到基質效應，理論上標準品應盡量采用與實際樣本相同的物質作為基質。因此本實驗室研制的這批尿素、尿酸和總蛋白復合國家標準品基質為人源血清，且未添加任何抗菌藥物和防腐劑，通過濾膜過濾保證無菌。常規方法在生化分析儀上檢測尿素、尿酸和總蛋白復合國家標準品精密度良好、自動化程度高，適宜在短時間內同時檢測大量樣本，所以本研究采用常規方法進行均勻性檢驗。結果顯示尿素、尿酸和總蛋白復合冰凍人血清國家標準品均勻性良好。在穩定性方面，要考慮長期穩定性（有效期）和短期穩定性，其中短期穩定性本研究考察了3個不同溫度：-20 ℃、2～8 ℃和20～25 ℃。短期穩定性與候選品運輸、使用過程等外部因素有關。長期穩定性與-70 ℃貯存條件下血清尿素、尿酸和總蛋白的變化有關。血清成分在-70 ℃貯存條件下穩定性可以持續2～7年。因時間所限，本批標準品長期穩定性觀察時間僅進行到12個月，以后將開展期間核查，持續觀察。根據文獻[15]和我國標準物質技術規范，大多數實驗室采用同位素稀釋氣相色譜-質譜法參考方法或WS/T 345—2011血清尿素方法為尿素標準品賦值，采用同位素稀釋氣相色譜-質譜法、同位素稀釋液相色譜-質譜法參考方法或血清尿酸酶法為尿酸標準品賦值，采用YY/T 1195—2011血清總蛋白測定參考方法為總蛋白標準品賦值。測量前均對儀器進行校準、驗證和維護，以確定最佳工作條件，結果令人滿意。

綜上所述，本實驗室研制的尿素、尿酸和總蛋白復合冰凍人血清國家標準品，穩定性、均勻性、互通性良好，定值結果準確。這批標準品將主要應用于尿素、尿酸和總蛋白常規方法的校準和評價，從而促進檢測結果的互認，保障對尿素、尿酸和總蛋白體外診斷試劑的監管。