大鼠急性一氧化碳中毒后c-fos蛋白的表達研究

黃衛巍,陳 陽

（皖南醫學院：1法醫病理學專業2016級；2法醫學院病理教研室，安徽蕪湖241002）

一氧化碳中毒是法醫學實踐中十分常見的死亡原因之一。關于一氧化碳中毒死亡的鑒定主要是依據碳氧血紅蛋白致死飽和度、尸體現象(血液及組織呈現櫻桃紅色）及案發現場的勘察等,然而在實際檢案中卻經常遇到特征性尸體現象不明顯、血液中HbCO遠低于致死飽和度（50%以下）等問題，給CO中毒死亡的判定帶來一定困難，并引發很多爭議[1]。c-fos蛋白屬于原癌基因家族，具有即時、快速反應的功能[2]。在正常的生理情況下，c-fos基因及蛋白僅有少量微弱的表達，當腦組織受到一系列的病理或生理的刺激后，c-fos蛋白將大量的表達。已有研究證實了c-fos基因及蛋白在腦挫傷、電流損傷等方面的表達[3-4]，而鮮見有關c-fos蛋白在急性一氧化碳中毒早期的研究報告。本研究采用靜態吸入染毒法建立大鼠急性一氧化碳中毒模型，運用Western blot?ting法檢測c-fos蛋白在一氧化碳中毒大鼠腦組織中早期的變化規律，免疫組織化學法觀察c-fos蛋白的表達部位，以期為法醫學推斷急性一氧化碳中毒死亡及死亡時間提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康雄性SD大鼠，25只，體重280～300 g(南京青龍山實驗動物中心提供）。隨機分為急性一氧化碳中毒組及實驗對照組，一氧化碳中毒組按中毒后不同時間點分為3 h、6 h、12 h、24 h組，每一時間組5只大鼠，實驗對照組5只，共25只大鼠。飼養期間保持空氣流通，及時更換墊料，適應性喂養一周，自由飲食，實驗前禁食12 h。

1.2 實驗材料和試劑

一抗c-fos抗體（ABCam，美國）,內參β-Tubulin抗體(abclona,美國),預染蛋白 Marker(Fermentas，美國),二抗羊抗兔IgG-HRP、山羊抗小鼠IgG-HRP、凝膠配制試劑盒(博士德有限公司),SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液5X（博奧森有限公司),RIPA裂解液、PMSF(碧云天生物技術有限公司），即用型SABC-POD試劑盒、增強型DAB顯色劑（天根有限公司）。60 L的染毒缸（皖南醫學院公共衛生學院提供），99.9%的一氧化碳氣體（蕪湖市永泰特種氣體有限公司），一氧化碳檢測管（上海豫東電子科技有限公司）。

1.3 模型制作

中毒組參照Thom SR方法[5]制做大鼠一氧化碳中毒模型并加以改進。將清醒大鼠放入體積為60 L的染毒罐內，然后向罐內注入濃度為99.9%的一氧化碳氣體。大鼠在罐內靜式吸入3 000～4 000 ppm一氧化碳氣體30～40 min。在此期間用一氧化碳快速檢測管監測染毒缸內CO氣體濃度，使氣體濃度保持恒定。實驗對照組將大鼠放入染毒缸內30～40 min，不通入一氧化碳氣體。

1.4 組織處理

在設定的不同時間點將大鼠斷頭處死，取左側大腦經預冷的生理鹽水清洗后，迅速放入-80℃冰箱冷凍備用，右側大腦放入10%的甲醛中進行固定，以用做HE染色及免疫組織化學染色。

取出凍存備用的腦組織加入RIPA裂解液及PMSF經勻漿、離心后，將提取的蛋白用NANOProp 2000檢測蛋白濃度確定上樣量，加入上樣緩沖液將蛋白100℃煮10 min變性，經過SDS-PAGE電泳、轉膜、免疫反應后，將膠片進行掃描，測定各組灰度值，計算其與內參β-tubulin的比值以用做統計學分析。

1.5 HE染色

將包埋好的組織蠟塊，制成5 μm厚的石蠟切片，在進行常規的脫蠟及水化后采用蘇木素-伊紅染色制成病理切片，采用光學顯微鏡觀察病理變化。

1.6 免疫組織化學染色

石蠟切片在進行常規的脫水、透明后，用3%過氧化氫封閉非特異性抗原，采用高溫高壓修復法進行抗原修復（2 000 mL的0.01 moL/L枸櫞酸鈉緩沖液pH 6.0，高壓鍋煮沸，放入玻片，待高壓鍋噴氣后計時3 min），c-fos抗體1∶100作為一抗，按照試劑盒提供的說明書進行操作。觀察c-fos蛋白的表達部位及強度變化。

1.7 統計學方法

實驗中所得數據應用SPSS 13.0進行統計學分析。計量資料用x±s（均數±標準差）表示，多個樣本均數比較采用單因素方差分析（one-way ANO?VA），兩兩比較LSD法，P＜0.05認為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 大鼠中毒后表現

大鼠染毒約5 min時出現躁動、興奮，圍染毒缸壁打轉，呼吸心跳加快。約15 min時，部分大鼠出現角弓反張、抽搐及聚集現象，后肢肌力明顯減退，少動但能對外界的刺激給予反應，尾尖及耳廓呈現櫻桃紅色。30 min時對外來的刺激無反應，有大小便失禁現象，呈昏迷狀態。將大鼠放置通風處逐漸恢復意識。對中毒死亡大鼠進行解剖發現內臟呈櫻桃紅色且有散在出血點，肝臟充血明顯，血液粘稠易凝固。實驗對照組大鼠在染毒缸內活動正常，呼吸均勻，解剖未發現明顯異常。

2.2 大腦皮質病理學觀察

在普通HE染色觀察大鼠實驗對照組與一氧化碳中毒3 h、6 h、12 h各時間組的組織結構大致相同，腦組織神經元核膜核仁清晰可辨，細胞間隙未見明顯水腫。在一氧化碳中毒24 h組中，腦組織輕度水腫，見圖1。

圖1 兩組大鼠腦組織的病理變化（HE染色，×200）

2.3 Western blotting法檢測c-fos蛋白的表達情況

與一氧化碳組比較，c-fos蛋白在對照組中表達較少，差異具有統計學意義（P＜0.05）。在一氧化碳中毒各時間組中c-fos蛋白表達水平隨著時間的延長呈現一種“雙峰”趨勢，即3 h明顯升高后，6 h略為下降，12 h再次升高達高峰，24 h降低（P＜0.05），見表1，圖2。

表1 c-fos蛋白表達灰度值(x± s，n=5）

圖2 c-fos蛋白的表達條帶

2.4 免疫組織化學法檢測c-fos表達情況

c-fos蛋白免疫組織化學染色后呈黃褐色，主要定位于神經細胞胞漿內，胞核中亦見有少量的表達。在實驗對照組中大鼠腦組織皮質區內見有少量的c-fos蛋白表達，而在一氧化碳中毒組則呈強陽性表達，見圖3。

3 討 論

一般情況下，一氧化碳中毒是由于吸入汽車廢氣、木炭、煤塊、燃氣灶、燃油等不完全燃燒，或者是在火災等環境下發生的[6-8]。一氧化碳中毒的機制主要是CO進入機體后與血紅蛋白結合，形成碳氧血紅蛋白（HbCO），碳氧血紅蛋白不易解離釋放氧氣，故造成機體缺氧，其病理特點主要是組織缺氧所致的各種器官功能障礙，重則危及生命。在法醫鑒定中，一氧化碳中毒主要依靠檢測碳氧血紅蛋白的濃度及尸體的特征性征象“櫻桃紅”來進行判定。由于碳氧血紅蛋白濃度受自身疾病、飲酒情況及CO來源的不同影響較大，給鑒定也帶來了一定的困難[9-11]。所以尋找敏感可靠的生化指標成為法醫學者努力探索的方向。

圖3 各組腦組織免疫組織化學染色（SABC法，×400）

c-fos基因是一種參與多種細胞功能的原癌基因，也是即刻早基因家族（immediate early genes,IEG）之一，早在三十多年前就已成為研究腦組織中的早期基因，多項研究表明不同的刺激能誘導c-fos的表達[12]。c-fos基因與c-jun基因編碼的蛋白相結合，形成AP-1轉錄因子，此蛋白可作為第三信使進入細胞核，調節靶基因的轉錄，從而使外界刺激信號與基因表達偶聯，參與一系列的生理或病理活動的調節[13-14]。在正常的人和大鼠的腦組織中，c-fos蛋白表達量較少，當外界的刺激如缺氧缺血作用于大腦時，c-fos基因的表達量就會發生顯著且快速的改變[15-17]。

本實驗在建立大鼠一氧化碳中毒模型的基礎上檢測c-fos蛋白在急性一氧化碳中毒后腦組織中的表達變化。一氧化碳中毒模型的建立主要有三種：靜態吸入染毒法、動態吸入染毒法及腹腔注射染毒法。動態吸入染毒法制備模型時吸入濃度穩定且能較好的避免二氧化碳蓄積和缺氧的缺點，但其一氧化碳氣體消耗量大且不適宜小型動物的模型制備。腹腔注射法雖能很好地控制氣體量，但與正常人體中毒方式不符，且中毒較深[18]。本實驗采用靜態吸入染毒法制備大鼠一氧化碳中毒模型，采用一氧化碳檢測管監測染毒缸內一氧化碳的濃度，且染毒缸較大，可避免染毒過程中的二氧化碳蓄積及氧分壓降低對本實驗的影響。能使大鼠在正常呼吸的情況下中毒，符合人體中毒方式。

本研究發現在急性一氧化碳中毒后早期腦組織病理學形態改變不明顯。在實驗對照組c-fos蛋白有少量的表達，可能與處死時的刺激有關。而一氧化碳中毒組c-fos蛋白在腦組織表達迅速增加，3 h表達升高，6 h略為下降，12 h再次升高達高峰，24 h時下降。這可能是當一氧化碳進入機體，神經系統缺氧而應激性上調c-fos蛋白，從而達到對神經系統的保護作用。隨著時間的延長，c-fos蛋白逐漸下降，但仍高于對照組。而12 h再次升高，可能是神經系統的復氧損傷所造成，也可能是c-fos蛋白的促凋亡作用引起的繼發性損害，有待進一步研究。在本實驗過程中還發現大鼠在輕度中毒后，后肢肌力即減退，隨著中毒程度的加深，肌力逐漸喪失，這也揭示了在中毒案件中，死者一旦中毒就很難逃離中毒現場，也是其死亡率高的原因。

本研究成功復制了大鼠一氧化碳中毒模型，通過模型研究證實了c-fos蛋白在一氧化碳中毒中的表達與Tang YP的研究結果一致[19]，且發現在一氧化碳中毒后腦組織病理未發生變化之前c-fos蛋白即開始表達并隨著時間的延長表現出一定的規律性,對防治一氧化碳中毒遲發性腦病的發病有一定的臨床意義。c-fos蛋白表達呈現出較好的即時性以及時間的規律性，為急性一氧化碳中毒的法醫學鑒定和中毒時間的推斷提供了實驗基礎。下一步研究重點應著重探討c-fos蛋白在一氧化碳中毒腦損傷與其他類型的腦損傷在表達部位、強度及發生機制的差異性。

4 結 論

25只實驗大鼠隨機分為實驗對照組及一氧化碳中毒組。Western blotting法檢測c-fos蛋白在腦組織的變化規律，免疫組織化學法觀察c-fos蛋白的表達部位。結果顯示：對照組大鼠腦組織內有少量的c-fos蛋白表達，一氧化碳中毒組在3 h時即可觀察到c-fos蛋白的大量表達，6 h略為下降，12 h表達至高峰，之后逐漸下降，呈“雙峰”趨勢，且與實驗對照組相比皆有差異性。提示c-fos蛋白的表達和一氧化碳中毒后經過時間呈現一定的相關性。