藤丹膠囊質量標準方法的改進

李 青 吾金卓瑪 戴 涌 康小鳳 王夢琪 張國躍

1. 陜西省食品藥品監督檢驗研究院中藥室，陜西西安 710065；2. 西藏阿里地

區食品藥品監督管理局檢驗檢測中心，西藏阿里 859000

藤丹膠囊由鉤藤、夏枯草、豬膽粉、桑寄生、丹參、三七等10 味藥物組成，該品種現行質量標準為國家食品藥品監督管理局國家藥品標準YBZ17172006-2011Z，具有平肝息風，瀉火養陰，舒脈通絡的功效，臨床上用于高血壓病Ⅰ、Ⅱ及肝陽上亢，陰血不足證，癥見：頭痛、眩暈、耳鳴、煩躁、失眠、心悸、腰膝酸軟、口咽干燥、舌紅或有瘀斑、苔黃、脈玄數或細而數者。原標準中川芎、豬膽膏、黃芪、三七的薄層鑒別重現性較差，三七的含量測定為薄層掃描法準確性差，且原標準中缺少對丹參、防己的控制。藤丹膠囊列為2015 年度國家藥品標準提高，因此此次實驗修訂了原標準中川芎、豬膽膏、黃芪、三七的薄層色譜，增加了丹參、防己的薄薄層鑒別，修訂了三七的含量，測定了三七中三七皂皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1的含量[1]，并建建立了高效液相色譜法測定藤丹膠囊中丹酚酸B 的的含量測定[2]，提高后的藤丹膠囊質量標準的檢驗指指標合理，檢驗項目均經過耐用的考察，因此可為該該制劑的質量控制提供檢驗依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

日本島津LC-30AD 系列高效液相色譜儀（紫紫外檢測器），Waters Empower 工作站；賽多利斯斯BP211D 和 BS224S電子分析天平；KQ-500DE 型數數控超聲波超聲清洗器；OVENS 075 型臺式干燥器。

1.2 其他

川芎（批號為120918-200809）、豬去氧膽酸（批號為100087-201411）、黃芪甲苷對照品（批號為110781-201314）、丹參（批號為 120923-201113）、丹參酮Ⅱ A（批號為110766-201721）、防己對照藥材（批號為121279-200301）、粉防己堿對照品（批號為110711-200507）、防己諾林堿對照品（批號為110793-200605）、三七皂苷R1對照品（批號為110745-201318，純度為 94.0%）、人參皂苷 Rg1對照品（批號為110703-201529，純度為95.0%）、人參皂苷Rb1對照品（批號為110704-201424，純度為93.7%）、丹酚酸B 對照品（批號為111562-201514，純度為93.7%）均為中國食品藥品檢定研究院提供。試劑均為分析純，水為超純水，乙腈為色譜純。藤丹膠囊及陰性樣品均由委托方提供。

2 鑒別實驗研究

2.1 川芎薄層色譜鑒別

2.1.1 供試品溶液的制備 稱取樣品10g，取甲醇50mL 加入錐形瓶中，超聲提取30min，用濾紙過濾，濾液置水浴上蒸干，加40mL 水使殘渣溶解，將上述溶液置分液漏斗中用石油醚（60～90℃）進行提取，提取4 次，每次30mL，棄去石油醚液，水液繼用乙酸乙酯振搖提取3 次，每次30mL，合并乙酸乙酯液，再用1% 氫氧化鈉溶液洗滌2 次，每次20mL，棄去堿液，提取液蒸干，用2mL 甲醇溶解殘渣，作為供試品溶液[3]。2.1.2 對照藥材溶液的制備 取川芎0.5g，取甲醇醇20mL 加入錐形瓶中，同供試品溶液的制法制成對對照藥材溶液。

2.1.3 陰性對照溶液的制備 取陰性對照10g，同供試品溶液的制法制成陰性對照溶液。2.1.4 結果 照薄層色譜法試驗，在同一硅GF254 薄層板上，將川芎陰性樣品、供試品、川芎藥材溶液分別點于其上，點樣量為各5 ～10μL，展開劑為環己烷︰三氯甲烷︰乙酸乙酯︰甲酸（2 ︰ 1 ︰ 10 ︰ 0.1），展開，取出，晾干，置（254nm）下檢視。供試品色譜中，在與川芎對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點，且陰性無干擾。見圖1。

圖1 川芎的薄層色譜圖

2.2 三七、黃芪薄層色譜鑒別

2.2.1 供試品溶液的制備 稱取樣品5g，混勻，加乙醚適量，置索氏提取器中，水浴45℃回流提取至無色，棄去乙醚液，取出濾紙筒，揮去乙醚，濾紙筒再置索氏提取器中，加甲醇適量，放置過夜，回流提取至無色，回收甲醇至干，用30mL 水溶解殘渣，用水飽和的正丁醇振搖提取3 次，每次30mL，合并提取液，用氨試液洗滌2 次，每次80mL，分取正丁醇液，蒸干，用5mL甲醇溶解殘渣，作為供試品溶液[4]。

2.2.2 對照品溶液的制備 用甲醇將黃芪甲苷對照品制成每1mL 含1mg 的溶液；再用甲醇將人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1及三七皂苷R1對照品制成每1mL 含1mg 的混合溶液，作為對照品溶液。

2.2.3 陰性對照溶液的制備 取三七陰性對照和黃芪陰性對照各5g，同供試品溶液的制法制成陰性對照溶液。

2.2.4 結果 照薄層色譜法，在同一硅膠G薄層板上，將黃芪甲苷對照品、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1及三七皂苷R1對照品溶液分別點于其上，點樣量為5μL， 展開劑為三氯甲烷︰甲醇︰甲酸︰水（13︰6.5︰0.5 ︰2）10℃以下放置的溶液[5]，展開，取出，晾干，噴以10% 硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與黃芪甲苷、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1及三七皂苷R1對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點，并且陰性無干擾。見圖2。

圖2 三七、黃芪的薄層色譜圖

2.3 丹參薄層色譜鑒別

2.3.1 供試品溶液的制備 稱取樣品15g，取乙醚50mL 加入樣品中，超聲30min，濾過，濾液揮干，用乙酸乙酯1mL 溶解殘渣，作為供試品溶液[6]。

2.3.2 對照藥材溶液的制備 另取丹參對照藥材0.5g，同供試品溶液的制法制成對照藥材溶液。

2.3.3 對照品溶液的制備 用乙酸乙酯將丹參酮IIA 對照品制成每1mL 含1mg 的溶液，作為對照品溶液。陰性對照溶液的制備：取陰性對照15g，同供試品溶液的制法制成陰性對照溶液。

2.3.4 結果 照薄層色譜法，在同一硅膠G薄層板上，將丹參藥材、丹參酮IIA、丹參陰性、供試品溶液分別點于其上，點樣量為10μL，展開劑為石油醚（60 ～ 90℃）︰乙酸乙酯（4 ∶ 1），展開，取出，晾干。供試品色譜中，在與對照藥材及對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點，陰性無干擾。見圖3。

2.4 防己的薄層色譜鑒別

2.4.1 供試品溶液的制備 稱取樣品10g，取甲醇100mL 加入樣品中，超聲提取30min，濾過，濾液過中性氧化鋁柱（中性氧化鋁 100 ～ 200 目，8g， 內徑為 1.5 ～ 2cm，105℃烘約 1h），流出液 60℃水浴蒸干，用10mL 水溶解殘渣，加氨水調pH 至9 ～ 10，用乙醚振搖提取2次，每次20mL，合并乙醚提取液，揮干，用1mL 甲醇溶解殘渣，作為供試品溶液[7]。

圖3 丹參的薄層色譜圖

2.4.2 對照品及對照藥材溶液的制備 用甲醇將粉防己堿對照品、防己諾林堿對照品制成每1mL 含1mg 的混合溶液，作為對照品溶液。另取防己對照藥材1g，同供試品溶液的制法制成對照藥材溶液。2.4.3 陰性對照溶液的制備 取防己陰性對照10g，同供試品溶液的制法制成陰性對照溶液。

2.4.4 結果 照薄層色譜法，在同一1% NaOH 溶液制備的硅膠G 薄層板上，將防己陰性樣品、防己對照藥材、混合對照品溶液、供試品溶液點于其上，點樣量為5μL，展開劑為二氯甲烷：丙酮：甲醇（6︰1︰1）[8]，展開，取出，晾干，噴以稀碘化鉍鉀試液進行顯色。供試品色譜中，在與粉防己堿、防己諾林堿對照品色譜和防己對照藥材色譜相應的位置上，顯相同的橙紅色斑點，陰性無干擾。見圖4。

圖4 防己的薄層色譜圖

3 三七的含量測定研究

3.1 色譜條件

色譜柱為 Agilent 5 TC-C18柱（250×4.6mm，5μm） ；以乙腈為流動相A，以0.1% 磷酸溶液為流動相B[9-11]，按表1 中的規定進行梯度洗脫；檢測波長為203nm，流速1.0mL/min，柱溫：35℃。

表1 流動相梯度洗脫表

3.2 對照品溶液的制備

精密稱取人參皂苷Rb1對照品38.49mg 及三七皂苷R1對照品23.09mg 各置10 量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，作為備用溶液，將人參皂苷Rg1對照品精密稱取11.66mg 置10 量瓶中，然后將上述人參皂苷Rb1對照品的備用溶液精密吸取2mL，將三七皂苷R1對照品的備用溶液精密吸取1mL 置此10mL量瓶中，再加甲醇稀釋至刻度即得。

3.3 供試品溶液的制備

取本品內容物10 粒，精密稱取1.0g，精密往具塞錐形瓶中加入水飽和的正丁醇50mL，密塞，稱定重量，電熱套加熱回流1h[12-14]，放冷，再稱定重量，用水飽和的正丁醇補足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續濾液25mL，用氨試液洗滌2 次（15mL、10mL），收集正丁醇液置蒸發皿中，水浴蒸干，殘渣用甲醇使溶解，轉移至2mL 量瓶中，加甲醇溶解至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

3.4 專屬性試驗

取不含三七的陰性樣品1.0g，按3.3 項下供試品溶液的方法制備陰性樣品溶液，將對照品溶液、陰性對照溶液和供試品溶液各10μL，分別注入高效液相色譜儀中，進行測定，結果陰性無干擾。見圖5。

3.5 線性關系考察

圖5 三七含量測定的HPLC圖

取三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1對照品溶液（每1mL 含三七皂苷R1 0.2309mg、人參皂苷Rg11.166mg、人參皂苷Rb10.7698mg 的混合溶液）分別進樣 5、6、8、12、14、18μL，在上述條件下測定峰面積，以三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1進樣量（μg）與峰面積（Y）作標準曲線，計算三七皂苷R1回歸方程為Y=357.8560X-6.9522，r=0.9998， 人參皂苷Rg1回歸方程為Y=487.2971X-122.6149，r=0.9999，人 參 皂 苷 Rb1回 歸 方 程 為Y=382.7172X-102.2878，r=0.9996，結果表明三七皂苷R1進樣量在1.1545 ～ 4.1562μg 范圍內，人參皂苷Rg1進樣量在5.833 ～ 20.9988μg 范圍內，人參皂苷Rb1進樣量在3.849 ～ 13.8564μg 范圍內，線性關系考察良好。

3.6 精密度試驗

取每1mL含三七皂苷R10.2309mg、人參皂苷Rg11.166mg、人參皂苷Rb10.7698mg 的混合溶液放入液相色譜儀，連續按上述色譜條件重復進樣6次，記錄每個對照品的峰面積，結果三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1峰面積的RSD 分別為1.50%、1.30%、1.32%，表明精密度良好。

3.7 穩定性試驗

取新制的批號為140503 的樣品，分別在制樣后0、4、8、12、16、20、24h注入液相色譜儀進行測定，計算其RSD 分別為2.13%、0.79%、0.70%，表明本品24h 內穩定性良好。

表2 三七皂苷R1回收率試驗結果

表3 人參皂苷Rg1回收率試驗結果

表4 人參皂苷Rb1回收率試驗結果

3.8 重復性試驗

取同一批號供試品（批號：140503）1.0g，精密稱定，按供試品溶液同法制備，平行6 份，精密吸取10μL， 注入液相色譜儀，測定，三七皂苷 R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1平均含量分別為1.37mg/g、4.54mg/g、3.06 mg/g，RSD 分 別 為 2.67%、0.43%、1.78%；三七中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1及人參皂苷Rb1的總量為3.56mg/ 粒，RSD 為0.92%，表明此實驗方法重復性良好。

3.9 加樣回收率試驗

分別往具塞錐形瓶中精密加入三七皂苷R1對照品溶液（0.6099mg/mL）1mL、人參皂苷Rg1對照品溶液（1.1086mg/mL）2mL、人參皂苷Rb1對照品溶液（0.7890mg/mL）2mL， 蒸干，平行 6 份，再取重復性試驗項下的樣品約0.5g（三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1平均含量分別為1.37mg/g、4.54 mg/g、3.06 mg/g），按供試品溶液同法制備，測定含量，平均回收率分別為98.40%、102.07%、101.16%，RSD 分別為 2.80%、2.49%、2.27%，表明回收率良好。見表 2、3、4。

3.10 樣品含量測定

取11 批次藤丹膠囊，與供試品同法制成供試品溶液，分別精密吸取供試品溶液10μL，注入液相色譜儀，測定，結果見表5。3.11 三批三七藥材的含量測定

表5 11批樣品含量測定結果

取三七藥材0.1g，按《2015年版藥典一部》三七項下的方法，進行測定，結果3 批三七藥材中三七皂苷R1、人參皂苷Rb1及人參皂苷Rg1總量為5.6%、7.6%、6.8%。結果見表6。

表6 三批三七測定結果

4 丹參的含量測定研究

4.1 色譜條件

Agilent Extend-C18（250×4.6mm，5μm）； 流動相：乙腈 -1% 甲酸溶液（20 ︰80）[14-15]；流速：1.0mL/min；柱溫：35℃；檢測波長：286nm；進樣量 10μL。

4.2 對照品溶液的制備

精密稱取丹酚酸B 對照品54.99mg 置100mL量瓶中，加75% 甲醇稀釋至刻度，即得。

4.3 供試品溶液的制備

取本品內容物10 粒，精密稱取0.5g，置具塞錐形瓶中，精密加入75% 甲醇25mL，密塞，稱定重量，超聲提取（功率250W，頻率40kHz）30min，放冷，再稱定重量，用75% 甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得[15]。

4.4 專屬性試驗 驗

取不含丹參的陰性樣品0.25g，按4.3 項下供試品溶液的方法制備陰性樣品溶液，將對照品溶液、陰性對照溶液和供試品溶液各10μL，分別注入高效液相色譜儀中，進行測定，結果陰性無干擾。見圖6。

4.5 線性關系的考察

取丹酚酸 B 對照品溶液（0.5499mg/mL），分別進樣 2、4、6、8、10、12μL，在上述色譜條件下測定峰面積，以丹酚酸B 進樣量（μg）與峰面積（Y）作標準曲線，計算回歸方程為Y=635.2X-24.07，r=0.9999。結果表明丹酚酸B 進樣量在1.1 ～ 6.6μg范圍內，與峰面積呈良好的線性關系。

4.6 精密度試驗

取0.5499mg/mL 的對照品溶液放入液相色譜儀，精密吸取10μL，連續按上述色譜條件重復進樣6 次，記錄對照品的峰面積，結果丹酚酸B 峰面積的相對標準偏差為0.08%，表明精密度良好。

4.7 穩定性試驗

分別在制樣 0、2、4、6、8、12、24h 將批號為140503的樣品，注入液相色譜儀進行測定，計算其峰面積的RSD 為0.28%，表明本品24h 內穩定性良好。

4.8 重復性試驗

取供試品0.5g，精密稱定，平行6 份，按供試品溶液同法制備，精密吸取10μL，注入液相色譜儀，測定，平均含量為9.97mg/g，RSD 為0.34%，表明此方法重復性良好。

4.9 回收率試驗

向具塞錐形瓶中精密加入丹酚酸B 對照品溶液（2.7454mg/mL）1mL， 平行 6 份，蒸干，取重復性試驗項下的樣品約0.25g（丹酚酸B 含量9.97mg/g），按供試品溶液同法制備，測定含量，平均回收率為104.06%，RSD 為0.94%，表明該方法回收率良好。結果見表7。

表7 回收率試驗結果

4.10 樣品含量測定

取11 批次藤丹膠囊，與供試品同法制成供試品溶液，精密吸取供試品溶液10μL，注入液相色譜儀，測定。結果見表8。

表8 11批樣品含量測定結果

4.11 丹參藥材的含量測定

取丹參藥材適量，按《2015 年版藥典一部》丹參項下的方法，進行測定，結果兩批藥材中丹酚酸B的含量為3.4%、3.3%。結果見表9。

表9 三批丹參測定結果

5 討論

原標準中的川芎薄層鑒別為經典的紫外光（365nm） 下檢視的，但此次實驗發現樣品中的斑點不穩定，新生產的薄層色譜中斑點明顯，接近有限期的樣品在供試品色譜中未出現相同顏色斑點，故此次實驗更換提取方法及展開劑，結果重現性好斑點清晰。丹參屬于處方中含量較大的藥味，丹參酮ⅡA 能夠有效改善心肌供血，提高患者的心功能[16]，本次實驗中測定了丹酚酸B 的含量測定，故此次實驗測定藤丹膠囊中丹參及丹參酮ⅡA 的薄層鑒別。因原標準中豬膽膏、三七、黃芪的薄層鑒別斑點不清晰，重線性差，此次實驗就對其進行了修訂，結果新修訂的薄層色譜斑點清晰，耐用性良好，故列入此標準。由于防己在處方中也屬于主藥，故對其也進行了薄層鑒別研究，結果防己對照藥材、粉防己堿、防己諾林堿對照品的斑點均清晰，重現性，專屬性都符合要求，可以為本品的標準檢驗提供有效的檢驗依據。

三七的含量測定方法考察了流動相的比例、提取方式、提取時間、提取溶劑、色譜柱等因素的選擇），結果方法重現性好，實驗中還考察了三批三七飲片的轉移率，三七為原粉入藥，批號150401 藥材對應供試品的批號為 150501、150502、150601，轉移率分別為：95%、90%、92%，批號 150501 藥材對應供試品的批號為160401，轉移率為：91%，批號160401 藥材對應供試品的批號為160601、160602、160603，轉移率分別為：94%、97%、90%，結果證明轉移率基本合理，按照藥典規定的最低限再按90%轉移率計算出三七的含量為2.1mg/ 粒，故去掉11批樣品中低于2.1mg/ 粒的數據及11 批樣品中的最大值，其余9 批的平均值為2.8mg/ 粒，故暫定平均總含量（2.8mg/ 粒） 的 80 即 %2.2mg/ 粒為限度，即含量限度修訂為本品每片含三七以三七皂苷R1（C47H80O18） 、人參皂苷 Rg1（C42H72O14） 及人參皂苷Rb1（C54H92O23） 的總量計，不得少于 2.2mg/ 粒。

丹參的含量測定考察了不同的處理方法，如提取方法（ 超聲半小時、回流半小時），提取時間（15分鐘、30 分鐘、1 小時） 的考察，結果顯示超聲30分鐘的提取更完全一些，故確定了文中供試品溶液的制備方法，并采用了不同的色譜柱考察了耐用性。實驗中測定了3 批樣品所用2 批生產用丹參藥材，批號094Q150301 藥材對應供試品的批號為150501、150601，轉移率分別為：40%、40%，批號094Q150501 藥材對應供試品的批號為160401，轉移率為：39%，結果證明轉移率基本合理，按照藥典規定的最低限再按40% 的轉移率計算出丹酚酸B 的含量為3.6mg/ 粒，故去掉11 批樣品中低于3.6mg/ 粒的數據，其余7 批的平均值為3.9mg/ 粒，故暫定平均總含量（3.9mg/ 粒）的80%即3.1mg/ 粒為限度，即含量限度修訂為本品每片含丹參以丹酚酸B（C36H30O16）的含量計，不得少于3.1mg/ 粒。