穿心蓮內酯微球制備工藝的優化

李春蘭 楊小云 孫昌霞

1. 河南中醫藥大學第一附屬醫院藥房，河南鄭州 450001；2. 黃河科技學院醫學院藥學系，河南鄭州 450063

穿心蓮內酯是從天然植物穿心蓮中提取的主要有效成分之一。藥理實驗表明，穿心蓮內酯在治療心腦血管疾病方面有顯著的療效，另外還具有抗各種炎癥，抗菌、抗病毒、抗腫瘤、增強人體免疫力、保肝利膽等作用，具有毒性小，價格低的特點[1-3]。然而，穿心蓮內酯極低的生物利用度、極苦的口感，限制了其在臨床上的應用[4]。微球制劑是一種較熱門的研究技術，該制劑可以通過調節和控制藥物的釋放速度使藥物緩慢釋放，從而達到長效的作用[5]；又能阻止酶的降解，提高藥物的穩定性；掩蓋藥物的苦味；減少服藥次數；降低藥物的毒副作用，提高療效[6]。另外，微球粒徑較小，具有較好的靶向作用[7]。穿心蓮內酯微球的研究未見有報道，該文首次采用乳化交聯法制備穿心蓮內酯微球，該微球可有效掩蓋藥物苦味，提高生物利用度，擴大其臨床應用范圍。

1 材料

實驗用材料包括儀器、藥品及試劑兩大類。

1.1 儀器

FA1004 型電子天平購自上海良平儀器儀表有限公司；HH-2 雙孔電子恒溫水浴鍋購自上海科析試驗儀器廠；CJJ79-1 磁力攪拌器購自江蘇曉陽電子儀器廠；N-117M 雙目顯微鏡購自上海精密儀器儀表有限公司；TJ270-30 紫外可見分光光度計購自京北普析通用儀器有限公司；TL80-1 型醫用離心機購自蘇藥管械；KQ2200E超聲波清洗器購自昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 藥品及試劑

穿心蓮內酯原料藥（含量＞98%，西安開來生物工程有限公司，批號K120308）；穿心蓮內酯標準品（含量99%，中國藥品生物制品檢定所，批號131102） ；司盤-80（天津市四友精細化學有限公司，批號120528）；液體石蠟（天津市四友精細化學有限公司，批號100312）；95% 乙醇（鄭州派尼化學試劑廠，批號070320）；甲醛（洛陽市化學試劑廠，批號111008）；異丙醇（天津市德恩化學試劑有限公司，批號120605）；明膠（天津市興復精細化工研究所 批號120730）。以上試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 穿心蓮內酯含量測定方法的建立

2.1.1 選擇檢測波長 分別稱取適量的穿心蓮內酯和輔料，置于100mL 容量瓶中，用95% 乙醇在微熱條件下溶解定容后過濾備用。分別測定上述兩種溶液在200 ～ 400nm 波長范圍內的吸光度，結果顯示穿心蓮內酯在波長225nm 處有最大吸收，且此處輔料無干擾。

2.1.2 繪制穿心蓮內酯的標準曲線 精密稱取10mg 穿心蓮內酯，加適量的95% 乙醇溶解，移入100mL 的容量瓶中，并用乙醇定容，配成0.1mg/mL的儲備液。精密移取該溶液適量置于10mL 容量瓶中，用乙醇稀釋至刻度，配成濃度分別為5、10、12.5、20和22.5μg/mL 質量濃度的穿心蓮內酯標準品溶液，用紫外-可見分光光度計分別測定不同濃度的標準品溶液在225 nm 處的吸光度，以吸光度（A）對濃度（C）作圖，得 y=29.122x-0.2382，R2=0.9992 的線性回歸方程。結果表明，穿心蓮內酯在質量濃度為5.0 ～ 22.5 μg/mL 范圍內有良好的線性關系。計算得低、中、高濃度的回收率（%，n=3）分別為 100.33，100.47 和 100.93；RSD（%，n=3）為2.00，0.95 和1.29，精密度、回收率均符合要求。

2.2 微球的制備[8-9]

按乳化交聯法，稱取一定量的明膠置于小燒杯中，加適量蒸餾水充分膨脹半小時后，置于約60℃恒溫水浴鍋中，攪拌使其充分溶解，保溫備用。精確稱取20mg 穿心蓮內酯放置于小燒杯中，加入4 mL 液體石蠟，在一定的溫度條件下攪拌均勻，并在攪拌狀態下加入0.6mL 司盤-80，繼續攪拌至能用顯微鏡觀察到大小均勻的O/W 型乳狀液，然后將其冷卻至0 ～ 4℃，緩緩加入約1mL 化學交聯劑 （異丙醇0.625mL 和37% 甲醛0.375mL 混合），用20%的NaOH 溶液調節pH 值至8～9，繼續攪拌3h， 離心分離沉淀，沉淀用適量異丙醇離心5min，經過多次洗滌后，在室溫下干燥得到淡黃色粉末。

2.3 載藥量與包封率

采用可見分光光度法測定藥物的載藥量與包封率。取微球適量，精密稱定，置于研缽中加入適量的95%乙醇2mL 進行充分研磨，倒入試管。在40 ～ 50℃下超聲處理1h，放冷，過濾，得樣品溶液。精密量取1mL 樣品溶液放置于10mL 容量瓶中，用乙醇溶液定容，在225nm 波長處測定吸光度（A），通過標準曲線方程對微球中穿心蓮內酯的含量進行計算，得出其包封率、載藥量。（包封率= 微球中含藥量/ 投藥總量×100% ；載藥量= 微球中含藥量/ 微球總重量×100%）

2.4 正交實驗設計

2.4.1 正交試驗設計方法與優化[10-12]在單因素實驗的基礎上，選取3 個影響微球性質較大的因素，即明膠濃度（A） 、溫度（B） 、攪拌速度（C），每個因素選定3 個水平（見表1），按L9（3）設計實驗，實驗優化結果（見表2）。

表1 正交試驗水平表

表2 正交實驗優化

2.4.2 正交的極差和F比分析 為了考察以上單因素實驗中幾個因素及其水平對包封率是否有顯著影響，確定最佳工藝條件，采用F 比分析，結果見表3。

表3 F比分析表

根據極差分析（表2）和F 比分析（表3）數據可知，各因素對穿心蓮內酯微球包封率的影響大小順序是：A ＞ B ＞ C，結果表明，確定的最優方案為A3B1C2，即明膠濃度為20%，溫度為40℃，攪拌速度2000r/min。制得穿心蓮內酯微球的平均載藥量為3.88%，包封率為23.23%。

2.5 最佳制備工藝驗證

按照上述正交設計試驗法篩選得到穿心蓮內酯的最佳工藝，重復制備3 批微球，所制得微球均為淡黃色粉末。顯微鏡下觀察微球的外觀形態，所得微球圓整、均勻，分散性、無粘連。采用可見光分光度法測定微球中所含穿心蓮內酯的含量，并計算載藥量與包封率，得其平均載藥量為3.92%，包封率為25.01%。

2.6 外觀形態觀察[13]

所得微球為淡黃色粉末，將微球置于雙目顯微鏡下觀察，可見微球分散均勻，無粘連。見圖1 ～ 2。

圖1 初乳（×40倍鏡）

圖2 微球（×40倍鏡）

3 討論

本實驗采用正交法對交聯乳化法制備穿心蓮內酯的工藝進行了優化，確定了最佳工藝，并進行了最佳驗證，結果表明此工藝工藝簡單、重現性好，易于操作，制備微球有一定的優勢。制備的微球圓整，均勻，具有分散型好，無粘連的優勢。并用靈敏度高，準確度高，重現性好的紫外分光光度法測定了微球中所含穿心連內酯的含量，結果顯示了穿心連內酯在波長225nm 處有最大吸收，且此處沒有輔料的干擾，標準曲線結果說明穿心連內酯在質量濃度為為5.0 ～ 22.5μg/mL 范圍內有良好的線性關系，得其得其平均載藥量為3.92%，包封率為25.01%。依據正交試驗的結果，通過極差和F 比分析，探討了明膠的濃度，攪拌速度，溫度三因素對交聯乳化法制備穿心蓮內酯微球包封率的影響，最終確定了明膠濃度為20%，溫度為40℃，攪拌速度2000r/min。發現明膠的用量影響最大，因為明膠作為微球的載體材料，其量的多少對微球的載藥量和包封率影響很大。明膠量少，藥品包裹不完全，造成浪費，明膠量多，又容易結塊，通過實驗得出，20%的明膠效果較好。其次是乳化的溫度高低對乳液形成影響較大，溫度越高不利于乳液形成較穩定的體系，影響微球的成型和載藥量，最終確定乳化的溫度為40℃。另外攪拌速度對穿心蓮內酯微球的粒徑與初乳乳滴的大小有密切關系，制備初乳時，攪拌速度不宜過快或過慢，因為低速攪拌粒徑會較大，高速攪拌則會產生大量的氣泡會降低微球的產量和質量，故制備初乳時宜采用中高速，2000r/min 是制得微球的平均載藥量和包封率最佳。穿心連內酯微球制備中，加入交聯劑的速度與微球的分散度有很大的關系，過快會出現嚴重的粘連現象，故應緩慢加入交聯劑[14-15]。穿心蓮內酯微球的研究未見有報道，本研究為開發穿心蓮內酯新劑型提供了思路和參考，也提高了穿心蓮植物的藥效價值。