阿爾茨海默病presenilin-1/presenilin-2雙基因敲除小鼠海馬Ptprd基因甲基化改變

羅斯譯 唐曉琴 李 昕 高子清 唐瓊瑤 阮思蓓 黃 娟 凌 鳳 唐亞平 唐明希

1. 西南醫科大學基礎醫學院病理教研室，四川瀘州 646000；2. 西南醫科大學附屬醫院病理科，四川瀘州 646000；3. 江蘇省麻醉學重點實驗室 徐州醫科大學, 江蘇徐州 221000；4. 西南醫科大學神經生物學教研室，四川瀘州 646000

阿爾茨海默?。ˋlzheimer’ s disease，AD）是最 普遍、危害最為嚴重的神經系統退行性疾病。AD主要在皮質、海馬區和聯系區存在大量神經元的喪失，其臨床特征為認知功能損害和漸進性記憶能力的喪失，病理特征為老年斑（senile plaques，SP）和神經原纖維纏結（neurofibrillary tangles，NFT）[1-3]。迄今為止AD 發病機制仍然尚未完全探明。近年來大量的研究表明，表觀遺傳修飾在AD 發病機制和

病理進程中發揮重要作用，DNA 甲基化是最典型、最穩定的表觀遺傳學修飾之一，在基因表達和調控中起著重要作用。研究發現使用基因敲除技術構造的小鼠模型（presenilin-1/presenilin-2 條件性雙基因敲除小鼠，dKO 小鼠）從腦的分子變化、電生理特征、組織形態、炎癥反應、認知和情緒行為等方面模擬出了臨床AD 患者隨時間發展的病理變化[4]。因此，本實驗通過對實驗組dKO 小鼠和對照組CBAC57小鼠的海馬組織基因組DNA 進行二代高通量測序并建立甲基化圖譜，進而探討與AD 相關的甲基化修飾基因。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 親代的基因敲除小鼠，其遺傳背景B6CBAF1，由美國Ya-Ping Tang 教授（Louisiana State University，USA）惠贈。其繁殖和鑒定如我們之前報道[5]。取12 月齡雌性dKO 小鼠和CBAC57 小鼠各3 只，dKO 雌小鼠的平均體重為（35.0±2.6）g，CBAC57 雌小鼠的平均體重為（37.0±1.8）g。本實驗小鼠飼養于西南醫科大學動物實驗中心，飼養人員經實驗動物從業人員培訓并獲得實驗動物專業崗位資格培訓合格證書（資格證書編號：2017221）。飼養環境為 SPF 級，12h 循環 1 次光照，常年室溫維持在（22±2）℃，攝食和飲水自由。所有動物實驗均得到西南醫科大學倫理委員會批準，并符合國家實驗動物福利倫理的相關規定。

1.1.2 海馬組織的采集 用乙醚麻醉小鼠后，迅速采用斷頸法將其處死，用組織剪將其毛皮剪開，眼科剪撥開顱骨并暴露全腦組織，將腦組織快速轉移至冰上的無菌器皿中，分離出海馬組織并將其裝入標記好的凍存管中，放入液氮中約30min，轉移到-80℃冰箱保存。

1.2 方法

1.2.1 提取基因組DNA DNA 提取的試劑全部來自于天根生化技術有限公司，按照該公司的TIANamp 提取試劑盒（目錄號DP304）說明進行操作。將提取后的DNA 進行PCR 擴增，將擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳并運用紫外分光光度計分析DNA 樣本的純度和濃度。

1.2.2 二代高通量測序 本次實驗與杭州聯川生物技術有限公司合作，測序部分交由聯川公司進行（測序儀為Illumina Hi-seq 2500），測序文庫的構建如Brant 等[6]所述，對測序后的數據采用NGSQCToolkit-v2.3 軟件過濾掉低質量的測序數據，再利用Bismark（vO.7.4）軟件將過濾后的數據參考基因組序列進行比對分析，詳細說明見我們之前報道[7]。發生甲基化的篩選標注為P＜ 0.05。

1.3 統計學方法

此研究對實驗組和對照組海馬組織基因組DNA 甲基化測序結果采用χ2檢驗，采用的統計學軟件為SPSS13.0，結合生物公司的edgeR 軟件分析，最終得到FC 值。FC 值為實驗組和對照組樣本發生甲基化個數的比值，P＜ 0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 小鼠海馬組織DNA質量分析

采用紫外分光光度計測定基因組DNA 樣本顯示：DNA 的濃度集中分布在100 ～ 140ng/μL，OD260/OD280 ≥ 1.8，見表 1。0.8% 瓊脂糖凝膠電泳檢測（100V，40min）結果：電泳條帶清晰完整，未見明顯的彌散和拖尾，符合二代高通量測序的要求，見圖1。

表1 各DNA樣本在二代高通量測序中的質量分析

圖1 DNA 樣本0.8% 瓊脂糖凝膠電泳圖（M ：DNA Marker ；T ：dKO mice ；C ：Control）

2.2 Ptprd基因甲基化篩選結果

將RRBS 測序后的結果同小鼠參考基因組序列用軟件Bismark（vO.7.4）進行比對后獲得了異常的低甲基化基因Ptprd（P＜ 0.05），再從中篩選出了異常的低甲基化基因Ptprd。Ptprd 基因位于第四號染色體外顯子, 起始位點為76140514，終止位點為76140703 的啟動子基因Ptprd 表現出低甲基化狀態（FC 值 =8.333，P＜ 0.05）。見表 2。

表2 Ptprd基因甲基化狀態

3 討論

本實驗通過提取中期dKO 小鼠海馬組織基因組DNA 進行二代高通量測序，對測序后的結果進行過濾處理，然后用生物軟件將其與同系同齡對照組CBAC57 小鼠進行比對分析，從中獲取了異常甲基化基因Ptprd。

Ptprd 基因編碼的PTPRD 蛋白屬于PTPR 家族，與PTPRS、LAR 在結構上具有高度同源性，皆含有胞外區、胞內區以及跨膜區，PTPRD 胞外區含有FN-Ⅲ樣結構域和免疫球蛋白樣結構域，其具有類似于細胞間粘附分子的作用，胞外區通過跨膜肽連接到胞內區，與相鄰的PTPRD 分子形成二聚體進而介導細胞骨架重構和遷移，在神經細胞軸突形成和導向中發揮重要作用[8]。研究證實Ptprd 基因編碼的PTPRD 受體型蛋白與腫瘤發生、發展、預后、細胞周期調節、免疫應答水平、基因轉錄水平、疾病轉歸等方面有關[9-11]。研究發現結腸和肺腺癌中存在Ptprd 基因的突變[12-13]。據報道，缺失的Ptprd 基因與乳腺癌的預后密切關相關[14-15]。Szaum Kessel M 等的研究[16]通過對喉鱗狀細胞癌中Ptprd 基因啟動子區域進行亞硫酸氫鹽焦磷酸測序，進而發現在喉鱗狀細胞癌細胞系中Ptprd 基因呈現高甲基化。Song 等[17]的研究通過采用聚合酶鏈反應（PCR）和甲基化特異性PCR 方法檢測Ptprd 基因啟動子甲基化表達譜在急性髄系白血?。ˋML）患者中的作用，從而發現Ptprd 在AML 中的出現過渡表達，抑制細胞增殖和克隆形成以及誘導細胞的凋亡。Chibnik 等[18]的研究發現Ptprd 基因與Tau 蛋白和記憶紊亂相關，通過調節Ptprd 水平可以降低Tau蛋白的病理改變。而Tau 蛋白的過度磷酸化正是形成AD NFT 的主要原因，進一步證實Ptprd 基因與AD密切相關。到目前為止，國內外沒有關于Ptprd基因甲基化在AD 發生和病理進程中的相關報道，本實驗通過測序后獲得低甲基化改變的Ptprd 基因，這提示低甲基化的Ptprd 基因可能參與了AD 的病程。

本研究為進一步探討AD 發生的病理進程、表觀遺傳機制、以及今后針對Ptprd 基因的AD 基因靶向預防、診斷、治療、預后判斷等有重要的意義。但由于AD 的發生、發展受多種因素影響，在今后的研究中還需加大樣本量，運用單基因甲基化測序、甲基化特異性PCR、RT-PCR、蛋白印跡和免疫組織化學等方法進一步驗證分析其甲基化狀態、轉錄水平及蛋白水平等改變情況，同時對比分析Ptprd 基因在早期和晚期dKO 小鼠中的甲基化狀態，從而更全面地了解Ptprd 基因在AD 早中晚期各階段的甲基化改變情況。