活化轉錄因子3對綠膿桿菌致急性肺損傷小鼠肺組織核因子-κB表達的影響

吳秀琳 李明霞 錢斕蘭 郭亮 吳學玲

急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征(acute lung injury/acute respiratory distress syndrome, ALI/ARDS)是由各種致病因素直接或間接損傷導致彌漫性肺間質及肺泡水腫，最終因炎癥反應失控而發生急性呼吸困難、低氧血癥和非心源性肺水腫的臨床危重癥，為常見的進展迅速的炎癥性肺疾病，是膿毒血癥、爆發性流感、嚴重急性呼吸綜合征(severe acute respiratory syndrome, SARS)、重癥肺炎等疾病的主要死亡原因[1-2]。近年來，雖然ALI/ARDS發病機制和臨床治療研究已取得了很大的進展，然而其發病機制復雜，尚無有效的治療方案，其發病率及病死率高居不下，病死率仍高達40%左右[3-4]。因此對ALI/ARDS發病機制及其防治的研究就具有重要的臨床意義。

近年來研究證實，ALI/ARDS本質是炎癥反應失控，但其發病機制尚不完全明確。其中，細菌感染是引發ALI的常見病因，綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa, PA)是院內感染最常見的致病菌之一。內毒素(LPS，革蘭氏陰性菌外膜的主要成分)可與脂多糖結合蛋白(lipopolysaccharide binding protein, LBP)不同位點結合后形成LPS/LBP/mCD4復合物，發揮致炎或抗炎雙重生物學效應[5-8]。LPS的類脂A與LBP的致炎位點結合，經CD14和TLR4信號跨膜轉導，可使NF-κB激活移位入核向胞內傳遞信號，啟動炎癥級聯反應導致炎癥過度表達，發揮其致炎作用；LPS的類脂A與LBP的抗炎位點結合，則促進LPS與HDL結合，對“持續的過激的炎癥反應”起到滅火作用[9]。活化轉錄因子3(activated translating factor 3, ATF3)即是近年新發現的一個炎癥調控因子，發現其與“高密度脂蛋白(high density lipoprotein, HDL)”結合是調控炎癥反應的關鍵[10]。在非感染性疾病，如呼吸機相關肺損傷(ventilator-induced lung injury, VILI)，ATF3亦可通過降低炎癥反應對肺損傷有保護作用，說明ATF3對炎癥反應可能有“剎車”作用[11]。本課題組前期實驗研究已證實ATF3對綠膿桿菌所致急性肺損傷小鼠的炎癥反應有抑制作用，表明其對TLR4介導的信號通路有負性調控作用[12]。因此本研究繼續采用綠膿桿菌所致急性肺損傷模型，探討ATF3對綠膿桿菌所致急性肺損傷小鼠肺組織NF-κB表達的影響，為ALI/ARDS的發病機制提供理論依據，并提供可能的新的治療靶點。

材料與方法

一、實驗材料

熒光標記的綠膿桿菌，系復旦大學中山醫院呼吸科宋元林教授贈送。C57BL/6(17.8～26.25 g)小鼠，SPF級，系于陸軍軍醫大學(第三軍醫大學)實驗動物中心購買。ATF3敲基因小鼠(18.9～24.91 g)，系經美國俄亥俄州立大學Tsonwin Hai教授同意，由武漢大學模式動物協同創新中心李紅良教授贈送，于陸軍軍醫大學(第三軍醫大學)新橋醫院動物中心飼養。小鼠適應3～4 d，隨機將小鼠分為4組，分別為野生型小鼠對照組(WC組，即予野生型小鼠滴入生理鹽水)、野生型小鼠急性肺損傷組(WA組，即予野生型小鼠滴入綠膿桿菌)統稱WT小鼠、ATF3-KO敲基因小鼠對照組(KC組，即予敲基因小鼠滴入生理鹽水)、ATF3-KO敲基因急性肺損傷組(KA組，即予敲基因小鼠滴入綠膿桿菌)，統稱ATF3-KO小鼠。PA滴入后分別于0、3、6、12及24 h(每個時相點5只小鼠)處理小鼠。

二、研究方法

1. 急性肺損傷小鼠模型的建立及實驗設計： ①綠膿桿菌菌液的配制：從-80 ℃冰箱取出并解凍原始菌種，并接種于哥倫比亞血平板，普通三區劃線后放入37 ℃孵箱中，24 h后可長出大量菌落。用接種環取適量1～2個菌落，置于無菌生理鹽水中，用DL-ZD1濁度計調至0.5個麥氏單位，相當于1.5×108cfu/ml(引自衛生部規范教材《微生物學和微生物檢驗》第二版)；②小鼠置于秤盤中稱重；③麻醉小鼠：將乙醚瓶口小心打開后，取醫用棉球一朵用乙醚沾濕，置于密閉的燒瓶內，隨之小鼠置入燒瓶內約1 min，見小鼠被乙醚麻醉后立即取出小鼠，進行后續滴鼻操作。乙醚麻醉過程中需注意掌握時間，若麻醉時間過短則在后續操作過程中小鼠易醒影響操作，若時間過長則小鼠容易死亡；④綠膿桿菌或生理鹽水滴鼻：乙醚麻醉滿意后，用左手提起小鼠頭頸部皮膚，頭部垂直向上，右手用10 μl移液器將綠膿桿菌菌液(1.5×108cfu/ml的濃度)或生理鹽水共50 μl經鼻滴入肺內，滴注過程中可見小鼠鼻孔處有氣泡產生，但嘴內無液體流出，表明綠膿桿菌經過呼吸道到達小鼠肺內；⑤全身麻醉小鼠：實驗設置時間點后，分別在相應時間點進行全身麻醉，用左手拇指和食指抓住頸部皮膚，固定并提起小鼠頭部，小指夾住尾巴，用戊巴比妥250 mg/kg以45 ℃方向進針進行腹腔注射麻醉小鼠。小鼠皮膚較薄，在注射時注意觀察藥物是否外漏；⑥肺泡灌洗：待麻醉成功后，將小鼠固定于操作板上，解剖頸部以暴露氣管，于氣管上端剪一小口，置入氣管導管，用生理鹽水1 ml反復灌洗3次，留取約0.7～0.8 ml左右灌洗液于EP管中，做好標記，放置于冰箱(-80 ℃)備用；⑦收集肺組織標本：將小鼠固定于操作板上，打開胸腔，暴露肺組織，小心取下肺組織，部分肺組織行石蠟包埋、切片及HE染色，部分用于提取蛋白。

2. 小鼠肺組織病理學檢查： 小鼠處理及實驗分組同前。(1)肺組織石蠟包埋及切片：酒精脫水：將肺組織從4%多聚甲醛(paraformaldehyde, PFA)中取出進行梯度酒精脫水：75%乙醇、80%乙醇、90%乙醇分別脫水30 min，100%乙醇脫水兩次，每次30 min；脫水透明：將肺組織置于透明劑二甲苯中進行透明兩次，每次30 min，以脫出組織中酒精;浸蠟與包埋：將已透明的肺組織置于已溶化的石蠟中，隨之放入60 ℃烤箱中。待肺組織完全浸于石蠟后，用石蠟包埋機進行包埋。放置于4 ℃冰箱過夜，待冷卻凝固成塊；切片：將包埋好的蠟塊固定于切片機上，用切片機切成薄片，切片厚度約為5 μm；(2)HE染色：將切下的薄片貼到載玻片上，置于45 ℃恒溫箱中烘干；脫蠟：染色前使用二甲苯脫蠟2次，每次10 min；由高到低濃度酒精梯度水化：分別于100%酒精，100%酒精，95%酒精，95%酒精水化各10 min，最后用ddH2O沖洗；蘇木素水溶液中染色3 min，用ddH2O沖洗3 min；用0.5%鹽酸酒精分色20 s，ddH2O沖洗1 min；用0.5%伊紅染色3 min，ddH2O沖洗2 min；60 ℃恒溫箱中將切片烘干，過夜；經純酒精脫水、二甲苯透明后的切片，滴上中性樹膠，蓋上蓋玻片封片，顯微鏡觀察切片。

肺損傷評分按照以下三項標準進行: ①肺泡和間質水腫；②肺泡出血；③中性粒細胞浸潤或聚集。每項標準又分四個等級：0=正常，1=輕度變化，2=中度變化，3=重度變化。最終的肺損傷得分為：三項標準評分的總和(總分為9)。

3. Western blot實驗檢測小鼠肺組織中ATF3的表達，以及檢測WT小鼠和ATF3-KO小鼠分別吸入生理鹽水、綠膿桿菌后6h 時肺組織P-P65、P-65、IKB-α表達的變化。

①提取總蛋白；②制膠；③上樣；④蛋白電泳；⑤切膠；⑥轉膜；⑦雜交(蛋白印跡)：濕轉后，取出PVDF膜，做好標記，進行Western blot；⑧封閉：電轉結束后，將PVDF膜放入裝有5%BSA的盤內進行室溫下封閉，搖床上進行1 h；⑨孵育一抗；⑩孵育二抗；洗膜；顯影：配制ECL發光液，取100 μl ECL顯色液A液與等體積B液混勻，然后滴加至PVDF膜上，并把顯色液在膜上鋪勻，用凝膠成像儀進行曝光顯影，并保存圖像。結果統計：用Photoshop軟件分析圖像，以β-actin作為內參進行標準化，用Quantity One對圖像進行灰度值統計。

三、統計學方法

運用SPSS13.0統計軟件進行數據分析。所有數據均以均數±標準差表示。用單因素方差分析進行多組間的比較，組間的兩兩比較采用SNK檢驗。P<0.05為具有統計學意義。

結 果

一、肺組織病理變化

肺組織切片HE染色結果顯示：在WT小鼠(WC組)及ATF3-KO小鼠(KC組)吸入生理鹽水后，兩組小鼠肺組織病理變化不明顯：肺泡間隔增厚不明顯，中性粒細胞浸潤亦不明顯，無肺泡出血。WT小鼠(WA組)及ATF3-KO小鼠(KA組)在吸入綠膿桿菌后6 h后，肺組織出現典型急性肺損傷病理變化，表現為：中性粒細胞大量浸潤、肺泡結構破壞、肺泡出血、肺間質水腫。按照實驗方法部分的標準進行肺組織損傷病理評分，結果顯示KA組的得分要高于WA組，提示吸入綠膿桿菌后ATF3-KO小鼠(KA組)肺組織病變程度較WT小鼠(WA組)明顯重。

二、WT小鼠吸入生理鹽水及綠膿桿菌后時間梯度其肺組織ATF3蛋白量的表達

為了明確ATF3對于綠膿桿菌誘導的肺損傷中的作用機制，我們采用了Western biot的方法檢測了ATF3在小鼠肺組織中的表達。結果顯示，WT小鼠(WC組)吸入生理鹽水后肺組織中ATF3各時相點表達與空白組無明顯差異(P>0.05)；WT小鼠(WA組)吸入綠膿桿菌后肺組織中ATF3分別于3 h及24 h處高峰，其中24 h峰值高于3 h峰值，均較空白組存在顯著差異(P<0.05)，見圖1。

圖1 WT小鼠吸入生理鹽水及綠膿桿菌后時間梯度其肺組織ATF3蛋白量的表達(a,b,c,d，P<0.05)

三、WT小鼠及ATF3-KO小鼠分別吸入生理鹽水、綠膿桿菌后6 h 時P-P65、P-65、IKB-α表達

為明確ATF3對綠膿桿菌誘導的ALI中肺組織NF-κB表達的影響，采用了Western biot的方法檢測取6h時相點對比P65、P-P65、IKB-α的蛋白表達。ATF3-KO小鼠(KA組)吸入綠膿桿菌6 h后P-P65、IKB-α表達顯著高于KC組及WA組、WC組，存在顯著差異(P<0.05)。結果顯示，吸入綠膿桿菌后ATF3-KO小鼠NF-κB活性表達明顯增加，見圖2。

討 論

ALI/ARDS是由于各種肺內外致病因素導致的以嚴重呼吸困難和頑固性低氧血癥和非心源性肺水腫為特征的機體炎癥失控性急性臨床綜合征[1-2]。重度細菌感染造成的膿毒血癥是ALI最常見死亡原因之一，而綠膿桿菌是導致膿毒血癥中最主要的革蘭氏陰性桿菌細菌，其細菌內毒素的活性成分脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)則是ALI首位危險因素[13]。雖然通過有效抗生素及機械通氣等手段治療，但療效欠佳，病死率仍高。ALI/ARDS發病機制尚不完全明確，其中TLR信號通路的過度激活可能是其發病機制之一，因此尋找新的針對TLR信號通路的負性調控因子非常必要。

通過借助基因組分析和生物信息學手段，從大量調控基因中篩選出的一個具有負性調控作用的轉錄調節基因就是ATF3，其是一個應激反應誘導下的快反應基因，在炎癥信號通路中具有重要調控作用。根據既往研究報道及本研究前期實驗證實，ATF3敲基因小鼠巨噬細胞可釋放大量多種炎癥因子(如IL-1β、IL-6、TNF-α)，明顯高于WT小鼠及KC對照組，提示LPS與TLR4結合時會誘導ATF3的表達，故推測ATF3對TLR4介導的信號通路有負性調控作用[12,14-16]。據最新的研究表明，巨噬細胞產生的ATF3可抑制中性粒細胞在肺內的遷移，亦提示ATF3是TLR4信號通路中的重要的負性調節蛋白，其作用的發揮可能是通過Tiam2途徑[17]。在小鼠巨噬細胞中，ATF3能抑制趨化因子CCL4的表達和分泌，控制過度的炎癥反應[18]。ATF3可抗衡環切力(CS)和高通氣帶來的炎癥反應，提示其對VILI亦有保護作用[11]。上述結果及很多文獻均提示ATF3可降低炎癥反應，對炎癥反應有“剎車”作用，是TLR4信號通路中重要的負性調控基因[14，19]。基于文獻報道和前期研究結果，我們有理由相信上調ATF3的表達對急性肺損傷小鼠有保護作用，且推測ATF3可能通過負性調控炎癥損傷而參與調節ALI的發生發展。

圖2 WT小鼠及ATF3-KO小鼠分別吸入生理鹽水、綠膿桿菌后6 h時P-P65、P-65、IKB-α表達對比(a,b,c,P<0.05)

本實驗結果顯示，吸入PA后肺組織炎癥病理改變明顯，說明本研究中采用吸入綠膿桿菌懸液誘導建立的內毒素性ALI模型是成功的。本研究的前期預實驗結果發現，給予LPS腹腔注射后，ATF3 mRNA及蛋白表達高峰水平在2 h時相點，且6 h、12 h、24 h時相點表達水平仍是高于正常水平的。本試驗中WT小鼠吸入生理鹽水及綠膿桿菌均能誘導ATF3蛋白表達明顯增加，其中生理鹽水組在3 h時相點達最高峰，綠膿桿菌組在3 h、24 h時相點達最高峰，其中24 h較3 h峰值還高，均較空白組存在顯著差異，上述研究結果與文獻報道相一致[15，20-22]。再次證實了ATF3在應激信號出現后其mRNA水平能迅速提高這一現象，存在ATF3表達上調的適應性反應[23-27]。前期研究亦提示ATF3在綠膿桿菌誘導的ALI小鼠肺泡灌洗液中能夠抑制炎癥因子的表達，均證實了上調ATF3能負性調控綠膿桿菌誘導的ALI的肺組織炎癥損傷[12]。

以上的實驗結果提示ATF3對ALI有保護作用，而ATF3對ALI的保護作用則應歸因于其對TLR4信號通路的負調控作用。ATF3誘導機制較復雜，涉及多種信號轉導途徑。而氧化應激和TLR4信號通路是急性肺損傷發生發展的關鍵途徑[28]。Nguyen等[29]研究證實，ATF3被誘導而表達上調是通過TLR4下游的JNK/c-jun信號通路。為了進一步探討ATF3對于綠膿桿菌誘導的ALI的作用機制，我們采用了Western biot的方法檢測了NF-κB在小鼠肺組織中的活性表達。本文結果顯示，吸入綠膿桿菌后ATF3-KO小鼠NF-κB的活性表達明顯增加，且在6 h時相點達高峰，與既往報道相一致[15，21]。本文上述結果提示在綠膿桿菌誘導所致ALI中，ATF3負性調控炎癥反應可能是通過TLR4/NF-κB信號通路所完成。鑒于以上結果和文獻報道，提示TLR4/NF-κB信號通路可能是ATF3調控ALI肺部炎癥損傷的途徑之一[30]。

綜上所述，前期研究證實了ATF3對綠膿桿菌所致ALI小鼠有保護作用，即對過激炎癥反應有負性調控作用，而本研究則證實其作用機制可能是ATF3作用于巨噬細胞TLR4/NF-κB信號通道，從而發揮負性調控作用。這些結果提示上調ATF3的表達有望成為治療ALI的潛在靶點。

致謝：感謝復旦大學中山醫院呼吸科宋元林教授贈送的熒光標記的綠膿桿菌，感謝武漢大學李紅良教授贈送的ATF3敲基因小鼠。