核因子-κB和炎性反應因子對經導管動脈栓塞術后肝細胞損傷的作用探討

王貝然， 杜 偉， 余義俊， 吳春華

肝細胞癌（HCC）起病隱匿、生長快、較早發生轉移，患者確診時大多已失去外科手術切除機會，手術切除率不足 20%［1-2］。經導管動脈栓塞術（transcatheter arterial embolization，TAE）已廣泛用于治療中晚期HCC患者，但術后常出現不同程度的肝臟損害，甚至發展為肝衰竭，導致死亡率上升［3］。因此，如何減輕和避免TAE術對肝功能造成損害，成為改善預后的關鍵。研究表明核因子（nuclear factor，NF）-κB在細胞壞死和炎性反應發生過程中發揮著重要作用［4］，腫瘤壞死因子（TNF）-α 和白細胞介素（IL）-10作為參與炎性反應過程的重要炎性因子亦受到NF-κB調控［5-6］。本研究通過建立兔VX2肝癌模型并行TAE治療觀察癌旁組織中NF-кB表達以及TNF-α、IL-10含量變化，探討它們在TAE后肝細胞損傷中的可能作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與主要器材

后腿皮下荷VX2瘤兔2只（東南大學附屬中大醫院惠贈），健康新西蘭大白兔70只（大理大學實驗動物中心提供），體質量為（2.8±0.28） kg，雌雄不拘，普通飼料喂養。

主要實驗器材包括Philips 16排螺旋CT機、Toshiba TITAN 3.0T型 MR機、GE Innova-3100IQ型DSA機、自制實驗兔手術臺、自制小洞巾、各型號注射器、3%戊巴比妥鈉、硫酸慶大霉素注射液、0.9%氯化鈉溶液、碘化油、碘海醇、眼科剪、眼科鑷、培養皿、超凈臺、動脈夾、18 G穿刺針、4 F導管鞘、3 F SP微導管、微導絲、NF-κB鼠抗兔多克隆抗體（武漢博士德公司）、二抗（抗鼠/兔）試劑及二氨基聯苯胺（DAB）顯色試劑（丹麥 Dako 公司）以及 IL-10、TNF-α兔雙抗夾心法檢測試劑盒（上海古朵生物科技公司）。

1.2 兔VX2肝癌模型制作

隨機選取荷瘤種兔1只，經耳緣靜脈推注3%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）麻醉（本實驗均采取此麻醉方法）并固定，于后肢腫瘤處常規備皮、消毒，切開表皮，剝離腫塊并將周邊壞死組織清理干凈，最后將邊緣生長旺盛的魚肉樣腫瘤組織置于含50 mL 0.9%氯化鈉溶液和2萬U慶大霉素混合液培養皿中，用眼科剪將瘤塊剪成約1 mm3碎塊（圖1①②）；1 mL注射器抽吸瘤粒混合液（15～20個瘤粒/mL）后套用18 G穿刺針送至健康兔后腿皮下，以保種傳代；將實驗兔麻醉固定，備皮、消毒并鋪巾，劍突下正中偏左側縱向切開腹部，充分暴露肝臟，用眼科鑷將肝左葉完整拉出，1 mL注射器換用18 G穿刺針呈30°斜穿刺入肝臟1.5～2 cm，回抽未見血液及膽汁回流后注入瘤粒混合液1 mL（圖1③）并迅速用明膠海綿填塞穿刺通道，腹腔內灑入慶大霉素40萬U，紗布壓迫穿刺點止血3～5 min，無滲血后將肝臟放回腹腔內，關閉并縫合腹腔切口。為預防感染，術后連續3 d肌內注射慶大霉素40萬U［7］。

1.3 實驗模型分組及處理

造模后21 d分別行CT、MR檢查追蹤腫瘤種植及生長情況（圖1④～⑧）。共計造模成功60只，造模成功率87%（60/69）。將60只VX2肝癌模型兔隨機分為TAE組（碘化油0.2 mL栓塞供血肝動脈）、造影組（僅行肝動脈插管造影）（圖1⑨⑩）和對照組（不作處理），每組20只。兔全身麻醉后固定于操作臺上，右腹股溝附近10 cm范圍內備皮、消毒后皮膚切一小口，用18 G穿刺針穿刺進入股動脈后引入導絲，拔去穿刺針后引入4 F導管鞘，經導管鞘放入4 F導管，通過導絲選入腹腔干；3 F微導管通過4 F導管超選入肝總動脈，造影明確腫瘤供血動脈；進一步超選至腫瘤供血動脈作造影，可看到腫瘤區

圖1 兔VX2肝癌模型制作與實驗處理影像

出現“抱球征”，通過3 F微導管推注碘化油后用明膠海綿栓塞，術畢按壓穿刺點15 min。

1.4 實驗標本存取

TAE術和造影完成后24 h，3組實驗兔均統一處死，左上腹劍突下腹正中切口切取完整肝臟，分離瘤組織與周圍正常肝組織，選取癌旁正常肝組織（距腫瘤＞2 cm）［8］；對分離出的各組癌旁組織標本作標記，放入5 mL塑料試管經液氮罐冷卻，12 h后轉移至-80℃冰箱保存備用。

1.5 NF-кB 表達判定

將實驗標本固定后行石蠟包埋，切片后用EnVisionTM兩步法免疫組化法作NF-кB蘇木精-伊紅（HE）染色，具體步驟按照說明書進行。每張切片于400倍鏡下選取10個視野，依據細胞陽性表達數與被檢測蛋白表達部位陽性信號強度作出綜合評分。細胞陽性表達數計分：陽性表達細胞＜5%為0分，5%～25%為1分，＞25%～50%為2分，＞50%為3分；陽性信號強度計分：細胞無染色為0分，染成淡黃色為1分，染成黃棕色為2分，染成深棕色為3分。將細胞陽性表達數評分和陽性信號強度評分相加之和，作為判定結果標準：＜2分為陰性（-）表達，2～3 為弱陽性（+）表達，4～5 分為陽性（++）表達，6～7分為強陽性（+++）表達。

1.6 TNF-α、IL-10 蛋白含量檢測

采用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）法檢測標本中TNF-α、IL-10蛋白水平，具體步驟按照試劑盒說明書進行。

1.7 統計學分析

采用SPSS 22.0軟件對全部數據進行統計學分析。計量資料用t檢驗，以均數±標準差±s）表示，組間比較計數資料用χ2檢驗，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

免疫組化分析結果顯示，TAE組、造影組、對照組癌旁正常組織中NF-кB陽性表達率分別為75%（15/20）、35%（7/20）和 20%（4/20）；各組數據卡方檢驗顯示，造影組與對照組差異無統計學意義（P＞0.05），TAE組與造影組差異有顯著統計學意義（P＜0.001），TAE組與對照組差異有統計學意義（P＝0.011），見圖2、表 1。

ELISA檢測顯示，TNF-α、IL-10值在TAE組最高，高于造影組，對照組最低；方差分析對比顯示，造影組與對照組差異無統計學意義（P＞0.05），TAE組與對照組差異有統計學意義（P＜0.05），TAE組與造影組差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

3 討論

肝動脈和門靜脈為肝臟提供雙重血供，動脈血流阻塞時門靜脈可代償供血，以維持肝臟正常功能。約99%肝腫瘤由肝動脈供血，這為TAE治療HCC提供了理論支持［9］，因此TAE為無法外科手術治療的中晚期HCC患者提供了另一處理方案，有助于延長患者生命周期，提高生存率。然而即使采用超選栓塞治療，TAE依舊會對肝臟造成損傷。由于肝血竇及肝內側支循環豐富等特征，栓塞劑不可避免地進入癌旁正常肝組織并沉積于微小動脈和毛細血管，引起組織缺血缺氧，從而刺激肝組織產生大量活性氧和炎性因子，引發一系列復雜的內源性反應，導致肝細胞壞死、肝功能損傷［10］，影響患者預后。

圖2 3組癌旁肝組織HE染色與NF-кB表達

表1 NF-кB在癌旁肝組織中表達

表2 癌旁組織中TNF-α、IL-10測定值 ng/L

炎性反應是臨床最常見病理生理過程之一，可發生于機體任何器官和組織，急性炎癥時發生紅、腫、熱、痛等變化，且時常伴隨發熱、白細胞增多等全身癥狀。炎性反應實質是以TNF-α為代表的致炎因子與以IL-10為代表的抗炎因子之間全面抗爭的自我保護過程，其分歧抗爭貫穿炎性反應過程始終［11-12］。TNF-α 主要來源于單核巨噬細胞，一方面與TNF-α受體結合，破壞溶酶體致使酶外露而損傷組織，另一方面通過誘導組織上皮細胞活化，增高毛細血管通透性致使水腫液聚集阻礙細胞灌注和氣體交換而加重組織損傷［13］。鑒于TNF-α強烈的毒性作用，其在TAE后肝組織損傷中可能起到助推器作用。IL-10則主要來自單核-巨噬細胞和輔助性T細胞，通常具有抗炎和免疫調節雙重作用，能直接對內皮細胞和巨噬細胞等多種細胞產生強烈的抗炎和免疫抑制作用，減輕組織損傷［14］。機體受到各種原因所致刺激時，一方面致炎因子TNF-α等含量會增加，使局部組織細胞變性、壞死，發生損傷，另一方面通過激發抗炎因子IL-10釋放發揮機體抵抗疾病的潛能，以利于更好地清除致炎因子，修復損傷組織，從而使機體恢復至正常狀態［15］。如果促炎與抗炎雙方旗鼓相當，那么機體內環境就會相對平穩，損傷最終得以修復；相反，如果其中任何一方由于失控而表達過度，平衡就會打破，從而加重器官或組織損傷［16］。本研究發現TAE組匯管區及肝小葉周邊見大量中性粒細胞浸潤（圖2①～③），提示癌旁組織發生了嚴重損傷，而TAE組癌旁組織中TNF-α和IL-10濃度明顯升高，推測可能是TAE術中各種原因引起癌旁組織缺血缺氧，導致了炎性反應發生。

NF-кB 是由 p105、p100、p50、p52、RelA/p65、c-Rel和RelB等7種蛋白組成的發揮轉錄活性功能的二聚體，正常生理狀態下主要分布在細胞質中，與其抑制蛋白IκBα結合而不發揮轉錄功能。當細胞受到TNF-α、IL-10、缺血缺氧等致炎因素刺激時，IκBα發生氧化磷酸化被降解，NF-κB便失去束縛，進入細胞核中發揮轉錄活性功能，調控其下游多種炎性因子反應，對機體產生保護效應［17-19］。Chandra等［20］研究發現，嚴重缺血缺氧會導致NF-κB活化過度，使下游炎性因子TNF-α表達增強，進一步刺激IL-10合成，使炎性反應過程中促炎、抗炎平衡被打破，引起細胞壞死，最終導致組織損傷。本研究結果表明，與對照組和造影組相比，TAE組癌旁組織中NF-кB陽性表達率明顯升高，與上述觀點一致。

綜上所述，TAE術后癌旁肝組織功能損傷可能是術中栓塞劑進入癌旁肝組織引起缺血缺氧，NF-кB活化過度并調控下游炎性因子TNF-α和IL-10使其合成增多，破壞了炎性反應過程中促炎、抗炎平衡所致。因此，在今后臨床實踐中，可將NF-кB作為保護肝功能的靶點，通過抑制其過度表達減少TNF-α和IL-10過度釋放，盡可能減少甚至避免炎性反應過程中促炎、抗炎失衡發生，從而減輕對癌旁正常肝細胞的損傷，保護患者術后肝臟儲備功能，提高生存率。