早期二甲雙胍治療對糖尿病前期合并短暫局灶腦缺血后長期認知功能的影響

黎潔潔，彭玉晶，王擁軍

既往的流行病學數據表明卒中和糖尿病可增加阿爾茨海默病（Alzheimer disease，AD）的發病風險[1-3]。本課題組前期使用短暫局灶腦缺血或2型糖尿病動物模型的研究結果發現這些動物具有AD樣改變，包括認知功能障礙，腦內Aβ或磷酸化tau蛋白的增加[4-5]。糖尿病作為卒中的獨立危險因素，可加劇卒中引起的認知功能障礙[6]。糖尿病前期包括空腹血糖受損和糖耐量異常[7]。卒中患者中，約1/3合并糖尿病前期[8]。糖尿病前期同樣可導致認知功能障礙[9]。雖如此，糖尿病前期對卒中后認知功能的影響仍不清楚。二甲雙胍被推薦用于糖尿病前期患者預防糖尿病的發生[7]。本課題組前期研究表明，二甲雙胍可減輕糖尿病鼠顱內AD樣的病理改變[5]，而本次研究將分析二甲雙胍對糖尿病前期合并短暫局灶腦缺血大鼠認知功能的影響。

1 研究對象與方法

1.1 實驗動物及飲食 6周齡雄性Wistar大鼠接受高脂飲食（60%脂肪，20%碳水化合物，20%蛋白質，貨號D12492i，美國Research Diet公司）制作糖尿病前期模型，或與高脂飲食的膽固醇/糖含量匹配的正常對照飲食（10%脂肪，70%碳水化合物，20%蛋白質，美國Research Diet公司）。首都醫科大學動物關懷委員會同意所有實驗操作。

1.2 腹腔糖耐量實驗 分別在10周齡和14周齡時通過腹腔糖耐量實驗的方法評估是否出現糖尿病前期[9]。大鼠禁食12 h后，腹腔注射葡萄糖（2 g/kg），2 h后尾靜脈采血，通過血糖檢測試紙（拜耳）檢測血糖值。

1.3 短暫大腦中動脈閉塞（transient middle cerebral artery occlusion，MCAO） MCAO方法如前所述[4]，腹腔注射10%水合氯醛（3 ml/kg）麻醉14周齡的雄性Wistar大鼠。通過電加熱毯將動物體溫控制在（37±0.5）℃。將尼龍線插入頸內動脈，至稍有阻力時停止，90 min后拔除拴線。

1.4 二甲雙胍治療和生化指標檢測 高脂飲食喂養4周后將動物隨機分成二甲雙胍治療組[200 mg/（kg·d），腹腔注射[5]]和生理鹽水治療對照組。每2周稱量動物體重以調整藥物治療劑量。22周齡時通過血糖檢測試紙（拜耳）進行空腹血糖檢測；14周齡和22周齡時通過ELISA的方法檢測血清空腹胰島素濃度（貨號EZRMI-13K，Millipore公司）。

1.5 Rotarod旋轉棒實驗 分別在15、20周齡時進行Rotarod旋轉棒實驗評估運動功能。如前所述[4]，讓動物站在轉軸上1 min以熟悉滾動軸裝置及周圍環境。然后開始訓練動物在轉軸上學習行走：設定轉軸為加速運動，5 min內速度從4 rpm勻速加速到40 rpm，當動物從轉軸上掉落下來之后停止實驗。每天連續3次，每次間隔15 min，持續2 d。第3天開始正式測試。同樣設定轉軸5 min內速度從讓動物接受轉速4 rpm勻速加速到40 rpm。記錄動物從轉軸上掉下來時的時間和轉軸的速度。速度-時間指數=時間（s）×速度（rpm）。

1.6 Morris水迷宮 動物在21周齡時進行Morris水迷宮實驗評估認知功能[10]。參照迷宮（直徑160 cm，高度50 cm）的中心將水迷宮分為四個象限。整個實驗分為平臺不可視實驗和探索實驗。在平臺不可視實驗中，逃離平臺（直徑12 cm，高度28 cm）固定置于第四象限中央，距離水面2 cm。平臺不可視實驗包括連續5 d的訓練期。在訓練期中，每天接受3次訓練，每次間隔15 min。每次訓練的時候，動物依次順時針從四個象限放入水池，動物到達平臺后當次訓練結束，如果時間超過2 min無法到達平臺，當次訓練終止，將動物引導到逃離平臺，并讓動物在平臺逗留30 s，隨后擦干放入籠中。所有訓練期結束后的第2天進行探索實驗。整個探索實驗持續2 min。在探索實驗中，第四象限的平臺將被撤離，同時記錄動物在第四象限逗留的時間。通過水迷宮上方的攝像頭和迷宮軟件（上海濟良軟件技術公司）記錄分析動物游泳路線和時間。實驗人員將進行盲法操作。

2 結果

2.1 高脂飲食可誘導糖尿病前期 持續4周的高脂飲食即可引起糖耐量異常和體重增加，持續到8周時，這種改變更加明顯，同時還出現血清胰島素含量增加（表1），說明高脂飲食可誘導糖尿病前期的發生。

2.2 糖尿病前期對卒中后運動和認知功能的影響和正常飲食組相比，糖尿病前期大鼠的運動功能受損。糖尿病前期合并MCAO后，長期運動功能變差，但和正常飲食組相比，糖尿病前期并沒有影響MCAO術后短期的運動功能（表2）。在認知功能方面，所有動物隨著訓練次數增加，到達平臺時間逐漸縮短。然而，MCAO大鼠到達平臺時間多于對照組，這與探索實驗結果相似（表3）。同時，在探索實驗中，無MCAO的動物逗留在第四象限的時間更多（表4）。而與MCAO組相比，糖尿病前期合并MCAO的大鼠在第四象限逗留的時間更短（表4），提示這些動物空間記憶能力受損。另外，如表3所示，在到達平臺速度方面，有或無MCAO大鼠結果類似。

2.3 二甲雙胍治療對糖尿病前期合并MCAO的認知功能的影響 所有動物同樣具有空間學習記憶能力。二甲雙胍治療組找到平臺的時間更短（表5）。

但在探索實驗中，兩組動物逗留在第四象限的時間比較，差異無統計學意義（表6）。兩組動物到達平臺速度無差異（表5）。

表1 高脂飲食對生化指標的影響

表2 Rotarod旋轉棒實驗各組速度-時間指數

2.4 二甲雙胍對生化指標的影響 二甲雙胍治療可降低空腹血糖，并且有降低空腹胰島素水平的趨勢（表7），提示二甲雙胍治療改善認知功能可能與改善糖尿病前期狀態有關。

3 討論

卒中后認知功能障礙是臨床中常見的問題。糖尿病是缺血性腦血管病最常見的合并癥之一，并且和認知功能相關[11]。糖尿病前期是介于正常糖代謝和糖尿病之間的中間狀態，提示發生糖尿病的風險增加[12-13]。既往流行病學研究表明，約1/3無糖尿病史的缺血性腦血管病患者合并糖尿病前期[14]。更重要的是，糖尿病前期患者不僅是發生糖尿病和卒中的高危人群，也更容易發生認知功能障礙[15-17]。本研究通過高脂飲食成功建立糖尿病前期的動物模型，表現為糖耐量異常、肥胖和胰島素水平增加。和本課題組既往研究結果一致，短暫局灶腦缺血損害了認知功能[4]。而本研究進一步發現，高脂飲食引起的糖尿病前期加劇了缺血性卒中引起的長期認知功能障礙。

表3 Morris水迷宮實驗

雖然所有動物找到平臺的時間逐漸縮短，說明不管是否有糖尿病前期或MCAO，所有動物都具有空間學習記憶能力，然而不管在訓練期還是探索實驗中，糖尿病前期合并MCAO大鼠找到平臺時間更長，說明其空間學習記憶能力受損。臨床數據表明，糖尿病前期是卒中不良結局的危險因素[14]，MCAO術后運動功能障礙可能影響水迷宮實驗結果。但本研究結果表明，無論有無MCAO的大鼠，其到達平臺速度無明顯差異，提示水迷礙[20]，而其他研究卻發現接受二甲雙胍治療的糖尿病患者其癡呆風險明顯降低[21-22]。尸檢的結果也間接證實了二甲雙胍治療可以改善AD相關的神經病理改變[23]。研究人群差異，研究設計不同和糖尿病的嚴重程度差異可能是上述臨床研究結論不同的原因。在實驗室研究方面，既往研究表明，二甲雙胍可通過促進神經再生改善空間學習記憶能力[24]。本課題組前期研究同樣表明，二甲雙胍可改善糖尿病大鼠顱內AD樣的病理改變[5]。在本研究中，在糖尿病前期之后以及卒中發生前使用二甲雙胍，模擬了臨床常見的患者狀態，結果發現二甲雙胍能改善糖尿病前期合并缺血性卒中后認知功能障礙。糖-能量代謝狀態和Aβ蛋白，tau蛋白以及神經再生有關[25]，本研究檢測了相關生化指標，發宮實驗觀察到的空間學習記憶能力差異并不是由運動功能受損導致的。

表4 Morris水迷宮探索實驗平臺所在各象限逗留時間占總時間比例

表5 二甲雙胍治療對Morris水迷宮的影響

改善卒中后認知功能障礙的治療手段非常有限。近來的研究結果表明早期預防糖尿病可以降低認知功能障礙的風險[17]。生活方式干預和二甲雙胍治療被推薦用于糖尿病前期患者以預防糖尿病的發生[18]。與生活方式干預相比，二甲雙胍成本更低，并且不受患者活動能力的影響[19]。然而，二甲雙胍對認知功能的作用，目前仍存在爭議。有臨床研究發現二甲雙胍可導致認知功能障現二甲雙胍可降低空腹血糖。另一方面，臨床研究表明二甲雙胍可改善卒中結局[26-27]，而基礎研究表明二甲雙胍可減小梗死體積[28-30]。因此，本研究所觀察到的二甲雙胍對認知功能的影響可能與降低血糖、保護腦組織有關，這還需要后續的研究加以證實。

表6 二甲雙胍治療對Morris水迷宮探索實驗平臺所在各象限逗留時間占總時間比例的影響

表7 二甲雙胍對生化指標的影響

本研究存在以下局限性：首先，為了減少動物的死亡率，本研究采用缺血90 min的MCAO模型，這只能模擬一部分的臨床卒中患者；其次，二甲雙胍對缺血的基底節區或者遠端和記憶有關的海馬區的組織病理改變有何影響，本研究并沒有涉及，需要后續研究進一步闡述。

【點睛】約1/3卒中合并糖尿病前期，本研究為改善糖尿病前期合并卒中后長期認知功能障礙提供治療依據。