spautin-1對雨蛙素誘導的急性胰腺炎AR42J細胞凋亡及自噬的影響

張雪良 徐子琴 熊建華

自噬在急性胰腺炎(AP)發生發展中作用的研究是當前AP基礎研究領域的主要熱點之一。自噬是導致長壽命蛋白質或細胞器降解的主要生物學過程。自噬小體將底物與溶酶體融合形成自噬溶酶體，進而將底物進行降解[1-3]。有研究發現，大量自噬體在壞死的胰腺炎組織區域積聚[4]。楊淑麗[5]報道，3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine3-MA，3-MA)可抑制AP大鼠引發的細胞自噬，進而減輕胰腺病理損傷，其中caspase-3表達升高，Bcl-2表達下降，提示胰腺病理損傷減輕可能與3-MA誘發胰腺細胞自噬，促進腺泡細胞凋亡有關。另有研究報道，自噬抑制劑渥曼青霉素可阻止雨蛙素誘導的胰蛋白酶原激活，在一定程度上改善AP的損傷[6]。spautin-1是一個高效的自噬抑制劑，本研究應用spautin-1干預雨蛙素誘導的胰腺腺泡細胞，觀察細胞凋亡及自噬的改變，為AP診治提供實驗依據。

材料與方法

一、細胞株與試劑

AR42J細胞株購自中國科學院細胞庫，雨蛙素購自上海翊圣生物科技有限公司，spautin-1購自MCE公司，BGAM和乳酸脫氫酶(LDH)-細胞毒性測定試劑盒購自Sigma公司，細胞凋亡檢測試劑盒購自BD公司，兔抗人LC3 p62、Beclin1、β-actin抗體均購自CST公司。

二、方法

1．雨蛙素誘導AR42J細胞的AP模型建立及分組：AR42J細胞株在含有20%胎牛血清的F-12K培養基中常規培養，取對數生長期細胞，以0.8×106個/孔密度接種于96孔板，分為對照組、100 nmol/L雨蛙素處理組(雨蛙素組)、100 nmol/L雨蛙素聯合10 μmol/L spautin-1處理組(雨蛙素+spautin-1組)，每組設3個復孔。雨蛙素干預AR42J細胞的劑量參考文獻[7]。

2．AR42J細胞LC3、p62、Beclin1蛋白檢測：分別取雨蛙素組培養0、6、12、24 h的細胞以及對照組、雨蛙素組、雨蛙素+spautin-1組培養24 h的細胞，用裂解液提取細胞總蛋白，應用ABC法定量蛋白后常規行蛋白質印跡法檢測細胞LC3、p62、Beclin1蛋白表達，以β-actin為內參。兔抗人LC3抗體1∶50稀釋，兔抗人p62、Beclin1抗體1∶100稀釋，辣根過氧化物酶標記的IgG 1∶100稀釋。最后ECL發光，X片曝光、顯影、定影，用圖像掃描軟件測定各條帶灰度值，以目的條帶與內參條帶灰度值比表示蛋白相對表達量。

3．胰蛋白酶活性測定：采用BGAM試劑檢測細胞胰蛋白酶活性。分別取上述各組細胞，應用裂解液裂解細胞，與含BGAM的胰蛋白酶反應緩沖液(10 mmol/L Tris、20 mmol/L CaCl2、pH7.4)混合后置37℃孵育30 min，上熒光儀用380 nm激發光，測定450 nm處的熒光值(A410值)。

4．AR42J細胞凋亡檢測：應用細胞凋亡檢測試劑盒檢測。取對照組、雨蛙素組、雨蛙素+ spautin-1組培養24 h的細胞，預冷PBS洗滌兩次后用250 μl的結合緩沖液重懸，調整細胞密度至1×105/ml。取1 ml細胞懸液，分別加入5 μl PE-Annexin V和7-AAD，輕輕渦旋混勻，室溫避光孵育15 min，上FACScan流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

5．細胞壞死檢測：取對照組、雨蛙素組、雨蛙素+spautin-1組培養24 h的培養上清，應用LDH-細胞毒性測定試劑盒測定上清液中LDH活性，嚴格按說明書操作。以釋放到培養液中LDH的含量變化反應AR42J細胞壞死情況，根據公式計算細胞壞死率。細胞壞死率(%)=培養液的LDH活力(培養液的LDH活力-存在于活細胞內LDH活力)×100%。

三、統計學處理

結 果

一、雨蛙素誘導AR42J細胞自噬

雨蛙素組AR42J細胞的自噬相關蛋白LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、p62表達量以及胰蛋白酶活性均隨雨蛙素作用時間的延長逐漸增加，差異有統計學意義；而Beclin1表達量無顯著變化(表1，圖1)。

表1 雨蛙素處理AR42J細胞不同時間后自噬相關蛋白表達量及胰蛋白酶活性的變化

注：與0 h組比較，aP<0.05

圖1 雨蛙素處理AR42J細胞0(1)、6(2)、12(3)、24(4)h時自噬相關蛋白表達變化

二、spautin-1抑制雨蛙素誘導的AR42J細胞自噬

對照組、雨蛙素組、雨蛙素+spautin-1組細胞LC3Ⅰ表達量分別為0.68±0.05、0.65±0.06、0.24±0.01；LC3Ⅱ為0.41±0.03、1.26±0.15、0.71±0.08；p62為0.53±0.04、1.06±0.09、0.56±0.06，雨蛙素+spautin-1組表達量較雨蛙素組顯著下降，差異具有統計學意義(P值均<0.05，圖2)，各組Beclin1表達量分別為0.42±0.05、0.55±0.08、0.48±0.06，差異無統計學意義。提示spautin-1可抑制雨蛙素誘導AR42J細胞的自噬。

三、spautin-1抑制雨蛙素誘導的AR42J細胞胰蛋白酶活性

對照組、雨蛙素組、雨蛙素+spautin-1組胰蛋白酶活性分別為1.01±0.05、1.65±0.18、1.13±0.14，雨蛙素+spautin-1組較雨蛙素組顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)。提示spautin-1可抑制雨蛙素誘導AR42J細胞自噬障礙導致的胰蛋白酶原激活。

四、spautin-1促進雨蛙素誘導的AR42J細胞凋亡

對照組、雨蛙素組、雨蛙素+spautin1組的細胞凋亡率分別為(3.42±0.53)%、(6.58±4.01)%、(23.64±2.12)%，雨蛙素組的細胞凋亡率較對照組顯著增加，雨蛙素+spautin-1組又較雨蛙素組顯著增加，差異均有統計學意義(P值均<0.05)。提示spautin-1可促進雨蛙素誘導的AR42J細胞凋亡。

圖2 對照組(1)、雨蛙素組(2)、雨蛙素+spautin-1組(3)細胞自噬相關蛋白表達

五、spautin-1抑制雨蛙素誘導的AR42J細胞壞死

對照組、雨蛙素組、雨蛙素+spautin1組的細胞壞死率分別為(1.42±0.33)%、(27.58±3.46)%、(7.64±2.12)%，雨蛙素組細胞壞死率較對照組明顯增加，而雨蛙素+spautin-1組較雨蛙素組顯著下降(P值均<0.05)。提示spautin-1可抑制雨蛙素誘導的AR42J細胞壞死。

討 論

早期AP發生主要包括受損的腺泡細胞和炎癥反應誘發的胰腺實質壞死等關鍵病理反應過程[8]。在AP早期階段，通常在分泌后起作用的消化酶則在胰腺腺泡細胞中呈預活化狀態[9]，腺泡細胞自我消化直接導致胰腺損傷。然而，目前關于消化酶特別是胰蛋白酶原激活的機制仍不清楚。此外，胰腺腺泡細胞死亡方式主要有細胞凋亡和細胞壞死，細胞凋亡被認為主要起保護性作用[10]，而壞死則可引起全身性炎癥，導致遠端器官損傷甚至死亡[11]。

最近研究證實，自噬阻塞引起的自噬小體聚積可能是導致酶原激活的關鍵因素。在乙醇與脂多糖誘導的AP模型中，由于炎癥組織中的局部溶酶體相關膜蛋白2(LAMP2)缺失，自噬小體和溶酶體之間的融合降低[12]，導致自噬小體積聚，進而導致酶原激活。此外，抑制自噬流可導致組織蛋白酶B和組織蛋白酶C之間表達失衡，進而刺激了雨蛙素誘導的AP中胰蛋白酶原激活[13]。上述研究均證實了在AP過程中自噬流會被阻斷。由此，有學者提出了AP發病機制中自噬障礙的概念[14]。自噬囊泡積聚是AP早期重要事件[15]，其中LC3Ⅱ位于自噬溶酶體內膜上，可用于指示自噬的發生。自噬流升高導致LC3Ⅱ表達增加，自噬障礙導致LC3Ⅱ和溶酶體之間的融合降低也可上調LC3Ⅱ表達水平。本研究結果發現，雨蛙素處理細胞后，自噬相關蛋白LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、p62均隨著雨蛙素作用時間延長表達逐漸增加，LC3Ⅱ表達增加表明細胞發生自噬，同時p62表達也增加，說明細胞自噬起始正常，但下游不通，吞噬體與溶酶體不能融合，表明胰腺腺泡細胞AR42J中LC3Ⅱ的水平升高主要是由于雨蛙素誘導自噬障礙導致的，同時，胰腺炎自噬受損的另一個證據是自噬流正調節因子Beclin1的變化很小。本研究中雨蛙素處理后細胞LC3Ⅰ與LC3Ⅱ表達具有類似的趨勢。LC3Ⅰ在自噬障礙時被誘導表達上調[16]，因而其具有與LC3Ⅱ相似的變化趨勢。此外，本研究還發現，隨著雨蛙素作用時間增加，細胞中胰蛋白酶活性逐漸升高。由此可知，雨蛙素誘導AP導致自噬障礙，進而誘發胞內胰蛋白酶原激活。本研究通過spautin-1對雨蛙素誘導APAR42J細胞模型的作用發現，spautin-1可通過阻止AP細胞的自噬障礙，進而抑制胰腺細胞免受胰蛋白酶損傷、促進細胞凋亡并抑制壞死，提示spautin-1在體內可能起到緩解胰腺炎的效果。