系統性紅斑狼瘡患者外周血單個核細胞中RSAD2表達及意義

曲婧格，王也，李熙萌，聶英坤

(哈爾濱醫科大學附屬第二醫院，哈爾濱150086)

系統性紅斑狼瘡(SLE)是一種可能致命并伴有多系統損害的自身免疫疾病，以產生大量自身抗體為特征，并通過抗原抗體免疫復合物沉積導致組織損傷，但確切的發病機制尚不明確。干擾素(IFN)是一種可以干擾病毒復制或傳播的生物性蛋白質，包括Ⅰ型(IFN-α、 IFN-β等)、Ⅱ型(IFN-γ)及Ⅲ型(IFN-λ)三種類型[1]。近年研究表明，Ⅰ型IFN在SLE發病機制中起關鍵作用，IFN誘導基因如淋巴細胞抗原6復合體(LY6E)、IFN誘導蛋白1(IFIT1)在SLE患者PBMCs中顯著升高，并與其疾病活動度有一定的相關性[2,3]。但在同樣能被IFN誘導上調的系列基因中，S-腺苷甲硫氨酸基區域蛋白2(RSAD2)在SLE患者中的表達情況卻鮮有報道。2017年10月～2018年2月，我們對SLE患者外周血單個核細胞(PBMCs)內RSAD2的表達進行檢測，探討其與SLE患者疾病活動度和免疫指標的相關性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇同期在我院就診的SLE患者46例作為SLE組，其中男3例、女43例，年齡11～69(45.56±15.35)歲。SLEDAI積分[5](5.9±3.9)分，其中高疾病活動度(SLEDAI積分≥6分)25例、低疾病活動度(SLEDAI積分<6分)21例。納入標準：符合1997年美國風濕病學會(ACR)制定的SLE分類診斷標準[4]；外周血血清抗核抗體(ANA)、抗小核糖核蛋白(nRNP)抗體、抗Sm抗體、抗核小體抗體及抗Ro-52抗體、抗雙鏈DNA(dsDNA)抗體、補體C3、補體C4資料完整。排除標準：并發淋巴增生性或除SLE外的自身免疫性疾病(如類風濕關節炎、干燥綜合征和克羅恩病)、慢性感染疾病(如艾滋病)、活動性感染、經免疫抑制劑及糖皮質激素治療。另選同期在我院進行健康體檢的性別、年齡匹配的健康對照者33例作為對照組，其中男2例、女31例，年齡14～68(43.23±14.47)歲。收集SLE組外周血ANA、nRNP抗體、抗Sm抗體、抗核小體抗體及抗Ro-52抗體、dsDNA抗體、補體C3、補體C4資料。兩組性別、年齡差異無統計學意義。本研究經哈爾濱醫科大學附屬第二醫院倫理委員會批準，并取得受試對象的知情同意。

1.2 主要試劑 人外周血淋巴細胞分離液(天津市灝洋生物制品科技有限責任公司)；InvitrogenTMTRIzolTMReagent (Thermo Fisher Scientific)； Bulge-LoopTMmRNA qRT-PCR、M-MLV逆轉錄酶、SYBR Green、dNTP、DDT、RNase抑制劑、Oligo(dT)18、異丙醇、氯仿等(銳博生物科技有限試劑)。

1.3 PBMCs內RSAD2 mRNA表達檢測 采用RT-PCR法。抽取兩組晨起空腹靜脈血2 mL，加入EDTA抗凝管中，采用密度梯度離心法分離PBMCs，加入1 mL TRIzol，吹打至白色沉淀溶解后轉入無酶EP管中，-80 ℃保存。取出已加入TRIzol的標本，室溫解凍，依次加入氯仿、異丙醇、冰預冷的無水乙醇、無RNA酶DEPC水，充分溶解后于60 ℃中孵育5 min。進行逆轉錄反應，得到逆轉錄反應產物cDNA，并分別用無RNA酶的水稀釋10倍。檢索NCBI數據庫，查到人類RSAD2基因的cDNA全長序列，以DNA STAR軟件設計擴增模板的引物，以β-actin作為內參照基因。RSAD2上游引物5′-TTGGACATTCTCGCTATCTCCT-3′，下游引物5′-AGTGCTTTGATCTGTTCCGTC-3′；β-actin上游引物5′-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3′，下游引物5′-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3′。各引物均由博尚生物技術公司合成。配置總體積為20 μL反應體系，PCR循環條件95 ℃ 20 s，95 ℃ 1 s、60 ℃ 20 s共40個循環，95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min、95 ℃ 15 s共40個循環。對RT產物的細胞拷貝數進行標準化，以2-ΔΔCt為相對表達量。按照2-ΔΔCt值將SLE患者分為高RSAD2表達、低RSAD2表達兩個水平。

2 結果

2.1 兩組RSAD2 mRNA表達水平比較 SLE組、對照組RSAD2 mRNA表達水平分別為8.4±10.7、1.7±1.4，SLE組RSAD2 mRNA表達水平高于對照組(P<0.01)。SLE組中高疾病活動度者、低疾病活動度者RSAD2 mRNA表達水平分別為11.4± 12.7、4.9 ±6.4，高疾病活動度者RSAD2 mRNA表達水平高于低疾病活動度者(P<0.01)。

2.2 不同RSAD2 mRNA表達程度的SLE患者免疫指標比較 46例SLE患者中，RSAD2高表達23例、低表達23例。RSAD2高表達者ANA、抗nRNP抗體陽性率均高于RSAD2低表達者(P均<0.05)。見表1。

2.3 SLE患者RSAD2表達水平與SLE特異性抗體水平的相關性 SLE患者RSAD2 mRNA表達水平與ANA(r=0.39，P<0.01)、抗nRNP抗體(r=0.31，P<0.05)均呈正相關，而抗Sm抗體、抗dsDNA抗體、抗核小體抗體、抗Ro-52抗體及補體C3、C4均無明顯相關(P均>0.05)。

表1 不同RSAD2 mRNA表達程度的SLE患者免疫指標比較(例)

3 討論

SLE是由環境致病因素、遺傳風險因素等引起的一種常伴有靶器官損害的自身免疫性疾病，患病率和病死率呈持續增長，社會經濟負擔重，是一個嚴重的公共衛生問題。高疾病活動度是導致疾病進展的主要因素，其高疾病活動度嚴重影響患者的日常生活。早期或者臨床前期發現及診斷可以顯著改善或者治愈這種疾病，然而SLE的早期診斷仍是臨床難題。近年研究發現，在SLE患者中Ⅰ型IFN的血清水平與病情活動呈正相關，IFN誘導基因與SLE發病密切相關，高IFN基因表達的SLE患者年齡較低，有著更高的抗dsDNA抗體或者低補體，病程較短且往往有著更高的活動性[6]。特別是Ⅰ型IFN系統，可通過對一系列下游基因的調控誘導自身免疫，因此研究Ⅰ型IFN誘導表達基因與SLE的關系具有重要意義。

RSAD2是Ⅰ型IFN介導的與內質網相關的病毒抑制基因，又被稱作蝰蛇毒素(Viperin)或cig5，位于人類染色體2p25.2上，是一種有著廣泛抗病毒活性的宿主蛋白質，近年研究表明，RSAD2與免疫反應密切相關，可用于預測類風濕關節炎的病情進展[7]。薈萃分析發現，RSAD2對SLE有重要的調控作用，在SLE中較正常對照表達明顯升高[8]。進一步研究發現，SLE患者RSAD2的轉錄產物在CD3+、CD4+、CD19+B細胞及CD33+髓樣細胞中較正常對照細胞表達明顯升高[9]。同時，有基因芯片相關研究在篩選SLE患者與正常對照的差異表達基因中發現，RSAD2為顯著上調的差異表達基因。進一步在小鼠B淋巴細胞中進行qRT-PCR驗證，結果顯示在SLE鼠B淋巴細胞中RSAD2較正常小鼠B淋巴細胞仍然顯著上調[10]。本研究發現，SLE組RSAD2 mRNA表達水平高于對照組，SLE組高疾病活動度者RSAD2 mRNA表達水平高于低疾病活動度者，提示RSAD2表達升高可能與SLE的發生發展機制相關，并可以在一定程度上反映疾病的活動情況。

SLE的免疫異常涉及復雜的細胞間相互作用的過程，B淋巴細胞是SLE發病的直接參與者。抗原提呈細胞(APC)通過膜相關抗原受體(sIg、BCR)特異性捕獲并提呈抗原，誘導B細胞活化，產生大量自身抗體，與自身抗原形成免疫復合物，通過Toll樣受體配體，使B淋巴細胞處于高度活化狀態。多種因素均可影響B淋巴細胞的免疫活性，如免疫調節機制缺陷、免疫耐受性喪失、信號轉導異常等[11]。目前已經證實，SLE患者中存在B淋巴細胞受體信號通路的持續激活，基因分析顯示B淋巴細胞受體信號通路存在基因表達缺陷和免疫效應分子異常[12,13]。B淋巴細胞除了分泌自身抗體外，還可以表達自身抗原，激活T淋巴細胞，產生促炎細胞因子，包括TNF-α和IL-6等[14]。以上多種機制共同影響了SLE的發生發展，而IFN誘導產生的RSAD2，作為一個抗病毒基因，有研究表明其在銀屑病皮膚中過表達，其與IFNα誘導的抗病毒基因表達中的作用一致[15]，推測RSAD2的過表達與IFN誘導的其他基因共同在SLE發生發展中起著重要作用。SLE經典的篩選手段是通過檢測血清ANA水平。本研究發現，SLE患者中RSAD2高表達者ANA、抗nRNP抗體陽性率均高于RSAD2低表達者，且SLE患者RSAD2 mRNA表達水平與ANA、抗nRNP抗體均呈正相關，提示RSAD2的過表達可協助SLE患者體內產生自身抗體，進一步表明其可能通過影響了B淋巴細胞的免疫活性，從而影響SLE的發生發展。

綜上所述，SLE患者RSAD2的表達水平顯著增高，并與疾病活動度及免疫功能相關，表明RSAD2具有作為SLE生物標志物的潛力，抑制RSAD2基因的表達也可能成為治療SLE的一種新方向。