大黃素對肺炎鏈球菌肺炎小鼠肺組織炎癥反應及p38 MAPK表達的影響

謝璟，王榮麗

(西南醫科大學附屬醫院，四川瀘州646000)

肺炎鏈球菌是革蘭陽性雙球菌，正常情況下定植于人體上呼吸道，當人免疫低下或伴發病毒感染時，可發展成敗血癥、社區獲得性肺炎、腦膜炎、中耳炎等。據統計，每年大約有160萬人死于肺炎鏈球菌肺炎[1,2]。肺炎鏈球菌肺炎常選用抗生素治療，然而，抗生素耐藥肺炎鏈球菌正變得越來越普遍[3]。因此，研究非抗生素類藥物治療肺炎鏈球菌非常必要。大黃素是大黃、何首烏等的提取物，為蒽醌類衍生物，具有抗炎、抗病毒、抗微生物、利尿、舒張血管和抗癌等藥理活性[4]。研究發現，大黃素可有效抑制多種細菌感染。近年研究發現，絲裂原活化蛋白激酶p38(p38 MAPK)信號轉導通路參與了細胞增殖、分化、凋亡、炎癥等，被認為是介導肺炎鏈球菌所誘導的肺組織炎癥反應的關鍵信號分子[5]。2018年1～3月，我們觀察了大黃素對肺炎鏈球菌肺炎小鼠肺組織炎癥反應及p38 MAPK表達的影響，探討大黃素對鏈球菌性肺炎的抗炎機制，為臨床用藥提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑 清潔級健康雌性BALB/c小鼠32只，4～6周齡，體質量(18±1)g，購于重慶騰鑫生物技術有限公司。常規飼養2周后進行造模。肺炎鏈球菌標準菌株ATCC 49619購自廣東微生物菌種保藏中心。水合氯醛(源葉)；大黃素(索萊寶)；西力欣(頭孢呋辛酯片)；PBS溶液(ASPEN)；小鼠IL-1β、IL-6、TNF-α ELISA試劑盒(欣博盛)；Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa公司)；DAB顯色劑；Western blotting相關試劑(武漢拜意爾生物科技有限公司)等。

1.2 細菌懸液配置 肺炎鏈球菌復蘇后采用血瓊脂培養基(50 mL/L CO2環境，37.0 ℃恒溫)培育18 h，從瓊脂平板表面刮下肺炎鏈球菌，懸浮于無菌的生理鹽水中，用麥氏比濁法配制0.5號麥氏濁度的細菌懸液(細菌濃度約為1.5×108CFU mL)備用。

1.3 動物分組及模型建立 將32只小鼠隨機分為對照組、模型組、大黃素組和頭孢呋辛酯組，每只各8只。所有小鼠采用5%水合氯醛5 μL/g腹腔注射麻醉，模型組、大黃素組及頭孢呋辛酯組按照文獻[6]制備小鼠鏈球菌性肺炎模型，用無菌針頭刺破鼻黏膜后，從鼻腔緩緩滴入0.5麥氏濃度菌液50 μL，待其自動吸入，前期經預實驗行肺組織病理切片已證實模型成功。對照組刺破鼻黏膜后，從鼻腔滴入50 μL生理鹽水。

1.4 干預方法 造模成功后第2天，每組進行灌胃治療，給藥劑量根據小鼠體質量按成人1 d劑量折算，換算公式參照文獻[7]。大黃素組予以大黃素25 mg/(kg·d)灌胃，頭孢呋辛酯組予以頭孢呋辛酯50 mg/(kg·d)灌胃，對照組及模型組予以等量生理鹽水灌胃，均灌胃1次/d，連續灌胃7 d。

1.5 肺組織病理觀察 在末次給藥12 h后，將各組小鼠均以5%水合氯醛麻醉，固定于解剖板，打開胸腔，暴露肺組織，分離并取出左肺，以4%多聚甲醛固定后，行脫水、包埋、切片，HE染色，光鏡下觀察肺組織病理學表現。

1.6 肺組織IL-1β、IL-6、TNF-α水平檢測 采用ELISA法。取右肺上葉，使用電勻漿機勻漿后，于4 ℃下，12 000 r/min離心15 min，取上清液，采用雙抗體夾心法檢測肺組織IL-1β、IL-6、TNF-α水平，具體操作方法按照ELISA試劑盒說明。

1.7 肺組織p38 MAPK mRNA表達檢測 采用聚合酶鏈式反應(PCR)。取右肺中葉于-80 ℃保存，取約100 mg肺組織，通過TRIzol法充分溶解提取組織總RNA。在逆轉錄酶的作用下進行反轉錄，之后再以cDNA為模板行PCR擴增。p38 MAPK引物、GAPDH引物由武漢金開瑞生物工程有限公司合成，序列如下：p38 MAPK上游5′-GGAGGTGCCCGAACGATAC-3′，下游5′-TTGGCGTGAATGATGGACTG-3′，擴增長度144 bp；GAPDH上游5′-TGAAGGGTGGAGCCAAAAG-3′，下游5′-AGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3′，擴增長度227 bp。結束PCR后，采用ΔΔCT法計算目的基因的相對表達量。

1.8 肺組織p38 MAPK蛋白表達檢測 采用免疫印跡法(Western blotting法)。取右肺下葉-80 ℃保存，組織塊用預冷的PBS緩沖液漂洗，使用電勻漿機勻漿后，加入10倍于組織體積的組織蛋白提取試劑(使用前數分鐘內加入蛋白酶抑制劑)，冰浴徹底勻漿。將勻漿液冰浴30 min后，于4 ℃、13 000 r/min離心5 min，取上清液。采用BCA蛋白質濃度測定試劑盒測定樣品蛋白濃度。

2 結果

2.1 肺組織病理表現 對照組肺泡結構完整，肺泡腔內無滲出物，肺泡間隔無增厚，間隔內毛細血管無明顯充血、擴張充血及炎癥細胞浸潤。模型組可見肺泡腔內充滿滲出的纖維素，肺泡結構破壞，肺泡間隔增厚及毛細血管擴張明顯，肺間質見大量炎性細胞浸潤。大黃素組可見肺泡腔內纖維素滲出較模型組少，部分肺泡結構破壞融合，部分肺泡間隔增厚，肺間質有少量炎癥細胞浸潤，可見少量紅細胞。頭孢呋辛組可見肺泡腔內少量纖維素滲出，部分肺泡間隔增厚，肺泡腔及肺間質有少量炎性細胞浸潤，較模型組輕，可見少量紅細胞。見圖1。

注：A為對照組；B為模型組；C為頭孢呋辛組；D為大黃素組。

2.2 各組肺組織上清液中IL-1β、IL-6、TNF-α水平比較 模型組肺組織IL-1β、IL-6、TNF-α水平均較對照組增高(P均<0.05)，大黃素組、頭孢呋辛組肺組織IL-1β、IL-6、TNF-α水平均較模型組降低(P均<0.05)。見表1。

表1 各組肺組織上清液中IL-1β、IL-6、TNF-α水平比較

2.3 各組肺組織p38 MAPK mRNA表達比較 模型組p38 MAPK mRNA表達較對照組增高(P<0.05)，大黃素組p38 MAPK mRNA表達較模型組降低(P<0.05)。見表2。

2.4 各組肺組織p38 MAPK蛋白表達比較 模型組p38 MAPK蛋白表達較對照組增高(P<0.05)，大黃素組p38 MAPK蛋白表達較模型組降低(P<0.05)。見表2、圖2。

表2 各組肺組織p38 MAPK mRNA及蛋白表達比較

圖2 各組肺組織p38 MAPK蛋白表達水平(Western blotting法)

3 討論

肺炎鏈球菌感染性疾病是引起5歲以下兒童死亡的首要原因。目前治療鏈球菌性肺炎常選用抗生素治療，然而，抗生素耐藥性肺炎鏈球菌正變得越來越普遍。每年有120萬新的肺炎鏈球菌感染病例，并且越來越多的肺炎病例是由至少對一種抗生素耐藥的肺炎鏈球菌引起的。耐藥菌株的涌現大大限制了抗生素的治療效果，因此，對肺炎鏈球菌致病機制的深入研究及新藥的開發應用迫在眉睫。

IL-1β、IL-6和TNF-α是促炎因子，可調節多種細胞的生理功能，并在創傷、疼痛、感染等應激過程中起重要作用。機體感染肺炎鏈球菌時，巨噬細胞活化，產生大量IL-1β、IL-6、TNF-α，它們相互協同[8]。IL-1β、IL-6、TNF-α還可以通過激活p38 MAPK信號通路，促進炎癥因子的表達，擴大炎癥反應。本研究發現，模型組肺間質大量炎性細胞浸潤，肺組織IL-1β、IL-6、TNF-α水平較對照組增高，提示肺炎鏈球菌可誘導小鼠發生強烈的炎癥反應。

MAPK信號通路是細胞內重要的信號轉導系統之一，參與細胞增殖、分化、凋亡、炎癥等，與肺炎鏈球菌肺炎的發生密切相關[9]。目前在哺乳動物體內發現有4條MAPK通路，分別為p38 MAPK通路、c-JUN氨基末端激酶/應激活化蛋白激酶(JNK/SAPK)通路、細胞外信號調節蛋白激酶(ERK)通路和ERK5通路[10]。其中，p38 MAPK通路是信號轉導樞紐，參與多種細胞信號轉導。p38 MAPK信號通路可被多種應激刺激(熱休克、H2O2、缺氧、放射線、紫外線等)、炎性因子[IL-1β、IL-6、TNF-α、人成纖維細胞生長因子(FGF)]、脂多糖(LPS)和革蘭陽性細菌細胞壁成分激活，誘導巨噬細胞活化，促進IL-1β、IL-6、TNF-α等多種細胞因子的表達，介導炎癥反應，并且活化p38 MAPK信號通路，可與ERK、JNK及核因子-κB(NF-κB)等信號通路發生正反饋，級聯放大炎癥反應[11～13]。Cao等[5]認為，p38 MAPK是肺炎鏈球菌所誘導的肺組織炎癥反應的關鍵信號分子。Li等[14]研究發現，p38 MAPK信號通路可誘導肺炎鏈球菌小鼠巨噬細胞大鼠免疫應答。本研究發現，模型組肺組織p38 MAPK mRNA及蛋白表達均較對照組增高，結合模型組肺組織IL-1、IL-6、TNF-α水平較對照組增高，考慮p38 MAPK信號通路活化參與調控肺炎鏈球菌肺炎小鼠肺組織的炎癥反應。

大黃素是大黃、何首烏等中藥的提取物，現代研究表明，大黃素具有廣譜抗微生物活性。Ferro等[15]發現，大黃素可抑制福氏志賀氏菌和化膿性鏈球菌引起的感染。大黃素對幽門螺旋桿菌具有抑菌作用，抑制效果呈劑量依賴性，進一步研究顯示大黃素對幽門螺旋桿菌DNA損傷也呈劑量依賴性[16]。Su等[17]研究發現，大黃素能抑制金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、甲型鏈球菌等常見病菌甚至醫院耐藥菌感染，作用機制可能是破壞細菌細胞膜完整性。研究發現，大黃對包括金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌在內的12種微生物有抑菌效果，同時經大黃分離出的大黃素對這些微生物也具有抑菌效果，對鏈球菌的抑菌效果優于其他醌類化合物。

本研究結果顯示，大黃素組肺泡腔內纖維素滲出較模型組少、肺間質炎癥細胞浸潤減輕，肺組織IL-1β、IL-6、TNF-α水平較模型組降低，表明大黃素能抑制肺炎鏈球菌感染，減輕鏈球菌性肺炎的炎癥反應，降低IL-1β、IL-6、TNF-α等炎癥因子水平；大黃素組p38 MAPK mRNA及蛋白表達水平均較模型組低，提示大黃素能抑制p38 MAPK mRNA及蛋白表達，表明大黃素可能通過抑制p38 MAPK信號轉導通路的活化，從而減輕肺炎鏈球菌肺炎小鼠肺組織的炎癥反應。