1,25-二羥維生素D3對糖尿病腎病大鼠足細胞Angptl4、Desmin表達的影響

吳欣，黃健，劉暢，楊靜，陽柳，黃勻，李曉穎，于黔

(貴陽市第一人民醫(yī)院，貴陽550002)

糖尿病腎病(DN)是糖尿病最常見的并發(fā)癥之一，是引起終末期腎病的主要原因。足細胞損傷被認為是引起DN蛋白尿和腎小球硬化的關(guān)鍵因素，其損傷常表現(xiàn)為足突融合消失、細胞體積逐漸變小、陰離子電荷減少，最終脫落并從尿液中排出[1]。血管生成素樣蛋白4(Angptl4)是血管生成素樣蛋白家族的重要成員，主要分布在肝臟、脂肪組織、心肌、骨骼肌、腎臟[2]。最近的研究發(fā)現(xiàn)，腎小球足細胞分泌的Angptl4與腎臟病患者大量蛋白尿的形成相關(guān)[3]。結(jié)蛋白(Desmin)是一種細胞骨架中間的絲蛋白成分，正常情況下Desmin在足細胞無明顯表達，但在某些因素引起足細胞受損時，其表達量可明顯增加，因此可作為足細胞損傷的標志[4]。1,25-二羥維生素D3[1,25-(OH)2D3]最經(jīng)典的生物學效應是調(diào)節(jié)鈣磷代謝，近年研究發(fā)現(xiàn)，其對DN免疫炎癥反應的多個環(huán)節(jié)具有調(diào)節(jié)作用，活性維生素D3可以減少腎臟病患者蛋白尿以及足細胞表達維生素D受體。維生素D抗蛋白尿作用與血流動力學、血糖改變無關(guān)[5]，而足細胞是防止尿蛋白濾出主要的屏障，因此推測維生素D3可能通過作用于腎臟足細胞而減輕尿蛋白的排泄。2017年3～9月，我們觀察了1,25-(OH)2D3對DN大鼠腎組織足細胞Angptl4和Desmin表達的影響，進一步探討1,25-(OH)2D3腎臟保護作用的機制。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑 雄性 SD大鼠 30只，購買并飼養(yǎng)于貴州醫(yī)科大學實驗動物中心，體質(zhì)量220～260 g。1,25-(OH)2D30.25 μg/粒(上海羅氏公司)，溶于橄欖油配成混懸液(0.02 μg/mL)。鏈脲佐菌素(STZ，美國 Sigma公司)；1,25-(OH)2D3(上海羅氏公司)；大鼠Angptl4、Desmin抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；免疫組化試劑盒、濃縮型DAB試劑盒、Western blotting試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.2 模型制備與分組 大鼠適應性喂養(yǎng)1周后，隨機選取22只，采用一次性腹腔注射STZ方法制備糖尿病模型。禁食 12 h后，單次腹腔注射STZ 55 mg/kg，3 d后尾靜脈取血測血糖，以空腹血糖維持在13.9 mmol/L或隨機血糖在16.7 mmol/L以上為糖尿病模型制備成功。4周后大鼠出現(xiàn)蛋白尿和腎臟病理改變，為DN模型制備成功。共造模成功18只大鼠，隨機分為DN模型組(M組)、1,25-(OH)2D3干預組(D組)各9只。將未造模的8只大鼠作為正常對照組(N組)。

1.3 干預方法 D組在糖尿病模型建立后予1,25-(OH)2D30.1 μg/ (kg·d)灌胃， M組給予等量橄欖油灌胃，N組給予等量蒸餾水灌胃，均干預12周。干預期間每周測量尾靜脈血糖2次，對血糖過高(>26.0 mmol/L)的大鼠皮下注射適量胰島素，維持隨機血糖在16.7 mmol/L水平以上。

1.4 尿液指標檢測 干預12周末時，各組大鼠進代謝籠，收集24 h尿液，采用雙縮尿法測定24 h尿蛋白(24 h Upro)，采用ELISA法測定尿Angptl4水平。

1.5 血液指標檢測 留取尿液后處死各組大鼠，眼球取血，分離血清，采用全自動生化分析儀測定血BUN、SCr水平，采用ELISA法測定血Angptl4水平。

1.6 腎組織病理變化觀察 取各組大鼠右腎組織，置于10%甲醛固定液固定，石蠟包埋，切片厚約3 μm，行常規(guī)HE染色、PAS染色，在400倍高倍鏡下和電鏡下觀察腎組織病理變化。

1.7 腎組織Angptl4、Desmin蛋白表達檢測 ①采用免疫組化SP法。取各組大鼠右腎組織，按照試劑盒說明進行免疫組化染色，采用 PBS代替一抗作為陰性對照。以細胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。每張切片在400倍視野下隨機選取10個含腎小球的視野，以Image-Pro Plus圖像分析軟件測量目標區(qū)域面積、積分光密度，以兩項乘積計算平均光密度值。②采用Western blotting法。留取大鼠左腎于-80 ℃冰箱保存。制備SDS-PAGE 膠，腎組織勻漿40 μg，半干轉(zhuǎn)印跡系統(tǒng)(360 mA，60 min)至聚偏氟乙烯膜(PVDF)，5%市售脫脂奶粉室溫搖床封閉120 min，Angptl4、Desmin(1∶1 000)于室溫搖床孵育120 min，二抗(1∶5 000)于室溫搖床孵育60 min，以GAPDH為內(nèi)參照， DAB 避光顯影，用Image J分析軟件將圖片上每個特異條帶灰度值數(shù)字化。

2 結(jié)果

2.1 各組尿液、血液指標比較 與N組相比，M組、D組24 h Upro、尿Angptl4、血BUN、血Scr均升高，血Angptl4水平均降低(P均<0.05)。與M組相比，D組24 h Upro、尿Angptl4、血BUN、血Scr均降低，血Angptl4水平升高(P均<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠尿24 h Upro、尿Angptl4及血BUN、Scr、Angptl4水平比較

2.2 各組腎組織病理變化 HE染色示，N組腎小球體積、形態(tài)和結(jié)構(gòu)正常。M組可見腎小球因毛細血管球肥大導致體積增大，腎小球基底膜部分增厚，系膜增生明顯，腎小管上皮細胞偶可見空泡，小管內(nèi)可見蛋白管型，有大量炎癥細胞浸潤，腎間質(zhì)和小動脈無明顯改變。電鏡結(jié)果顯示，M組腎小球基底膜增厚，足突融合，符合DN的早期改變，因造模時間短，未見到DN晚期的結(jié)節(jié)性硬化。D組腎臟病理改變較M組減輕。

2.3 各組腎組織Angptl4、Desmin蛋白表達比較 ①免疫組化結(jié)果：N組腎小球及周圍腎小管組織結(jié)構(gòu)清晰，其腎小管、內(nèi)皮細胞、足細胞、系膜細胞無明顯陽性染色；M組Angptl4和Desmin的表達明顯增強，主要見于腎小球足細胞，而D組Angptl4和Desmin的表達較M組減低(P均<0.05)。見表2。②Western blotting結(jié)果：與N組相比，M組Angptl4、Desmin蛋白表達均上調(diào)(P均<0.05)；與M組相比，D組Angptl4、Desmin蛋白表達均下調(diào)(P均<0.05)。見表2、圖1。

表2 各組腎組織Angptl4、Desmin表達比較

圖1 各組腎組織Angptl4 、Desmin蛋白表達情況(Western blotting法)

3 討論

腎小球足細胞損傷是DN早期的重要分子病理特征，在DN 的發(fā)生發(fā)展過程中起著關(guān)鍵作用，且與蛋白尿密切相關(guān)[3]。而足細胞相關(guān)因子表達的改變是蛋白尿形成的一個重要環(huán)節(jié)。本研究發(fā)現(xiàn)，與N組相比，M組24 h Upro、血BUN、Scr明顯上升，表明DN大鼠模型建立成功。

Angptl4是一種分泌蛋白， 被認為是參與糖和脂質(zhì)代謝的蛋白，與糖尿病患者的糖脂代謝紊亂及胰島素抵抗有關(guān)[6]。近年研究發(fā)現(xiàn)，Angptl4蛋白參與了多種生理和病理反應，包括創(chuàng)傷修復、腫瘤、血管生成和氧化還原調(diào)控等。Angptl4在正常腎臟組織中少量表達，而在腎癌、藥物引起腎損傷、腎臟纖維化時表達增加。最近有研究發(fā)現(xiàn)，在足細胞相關(guān)疾病(如微小病變性腎病、膜性腎病)中，腎小球中足細胞分泌的Angptl4表達上調(diào)，提示Angptl4在腎臟損傷中可能發(fā)揮重要作用。Angptl4在足細胞中的過度表達可引起大量的選擇性蛋白尿、腎小球基底膜缺失以及足細胞足突彌散融合，表明Angptl4可能對腎小球基底膜的屏障功能有影響[7]。最新研究顯示，Angptl4可能在微小病變型腎病(MCD)蛋白尿的發(fā)生中發(fā)揮了重要作用[7]。Chugh等[8]研究發(fā)現(xiàn)，MCD小鼠足細胞、外周血清及尿液中Angptl4水平增加；通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)使小鼠足細胞特異性高表達Angptl4后，可使MCD小鼠腎小球濾過屏障唾液酸分泌降低，導致靜電荷減少，小鼠出現(xiàn)明顯的蛋白尿，表明腎小球足細胞特異性高表達Angptl4在MCD蛋白尿形成過程中起重要作用。研究認為，Angptl4在腎病綜合征患者中導致蛋白尿的發(fā)病機制可能是：病理狀態(tài)下，足細胞分泌的低唾液酸化的Angptl4與腎小球基底膜結(jié)合，改變了蛋白信號通路引起蛋白尿，然后隨著疾病進展，Angptl4逐漸向內(nèi)皮移動并累積，促進了足突的融合并進一步加重了蛋白尿的程度[7]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠蛋白尿和血、尿Angptl4的水平明顯上升，腎組織Angptl4的表達上升，提示Angptl4與DN大鼠的蛋白尿相關(guān)。

Desmin是一種細胞骨架中間絲蛋白，正常情況下僅在系膜細胞少量表達，足細胞不表達，當足細胞受損時，可大量表達[9]，因此也被作為反映足細胞損傷的標志蛋白。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠腎組織Desmin表達明顯升高，而Desmin作為足細胞損傷的標志，表明DN大鼠發(fā)生足細胞損傷。

1,25-(OH)2D3的生物學作用主要包括調(diào)節(jié)鈣磷代謝和骨的再建，調(diào)節(jié)細胞增生與分化，以及免疫調(diào)節(jié)等。許多研究發(fā)現(xiàn)，活性維生素D3可影響系膜細胞生長和炎癥反應，從而對進行性腎小球損傷具有保護作用。最近的流行病學調(diào)查顯示，活性VitD3及其類似物可以顯著降低CKD患者包括DN患者的蛋白尿[10]。VITAL研究是全球第一個安慰劑對照、隨機雙盲的多中心臨床研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，1,25-(OH)2D3在聯(lián)合血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑的基礎(chǔ)上，可顯著降低2型糖尿病患者蛋白尿水平[11]。在多種動物模型包括腎大部切除和阿霉素誘導的腎病模型中發(fā)現(xiàn)，給予維生素D類似物可以明顯降低蛋白尿，減輕足細胞損傷[10,12]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠蛋白尿和血、尿Angptl4的水平明顯上升，腎組織Angptl4和Desmin的表達上升，而1,25-(OH)2D3干預后，蛋白尿和血、尿Angptl4的水平下降，腎組織Angptl4和Desmin的表達下降，這可能是1,25-(OH)2D3發(fā)揮腎臟保護作用的機制之一。

綜上所述，在DN模型大鼠中，足細胞損傷后分泌Angptl4、Desmin增加，而1,25-(OH)2D3干預后腎組織Angptl4、Desmin蛋白表達減少，從而減少蛋白尿，減輕腎臟病理損害，提示1,25-(OH)2D3可能具有足細胞保護作用，為1,25-(OH)2D3臨床治療DN 提供了新的理論依據(jù)，但具體機制還有待進一步的科學研究。