黃連溫膽湯含藥血清改善小鼠脂肪細胞胰島素抵抗的機制探討

劉紫君，韓宇博，彭鵬，婁宏君，劉莉

(黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院，哈爾濱150040)

代謝綜合征(MS)是一系列能導致心腦血管疾病的代謝紊亂狀態，給患者和社會帶來的負擔日益嚴重，而IR及肥胖是引起和組成MS的關鍵[1]。脂肪組織是體內主要能量儲備系統，是胰島素作用的關鍵靶點，也是糖脂代謝發生的主要場所[2]，故常用脂肪細胞模型研究糖脂代謝。黃連溫膽湯是古代名方，符合MS辨證要點，本課題組前期研究證實其可明顯改善MS患者的多項代謝指標，尤其對于IR的各項指標均有很好的改善[3,4]。磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)是重要的胰島素受體后信號通路之一，從胰島素與受體結合到激活下游葡萄糖轉運蛋白4(GLUT4)向細胞膜移動完成葡萄糖攝取，中間經過多層的級聯信號傳導，該條通路中的環節發生異?？梢鹦盘杺鲗д系K，細胞利用葡萄糖能力下降，導致IR發生。2016年10月～2018年4月，我們以服用過黃連溫膽湯的大鼠含藥血清作用于小鼠脂肪細胞IR模型，觀察此含藥血清對脂肪細胞IR的改善情況，初步探討相關分子機制。

1 材料與方法

1.1 細胞、動物、試劑與儀器 3T3-L1小鼠胚胎成纖維細胞株購買于中國科學院細胞庫。SPF級雄性SD大鼠30只，購買于黑龍江中醫藥大學實驗動物中心，體質量(200±20)g，適應性飼養1周后用于實驗研究。Ori Cell TMSD大鼠骨髓間質干細胞成脂誘導分化培養基試劑盒(賽業生物科技有限公司)；葡萄糖測定試劑盒(中生北控生物科技公司)；SYBR qPCR Mix(日本Toyobo，TYB-QPS-201)；兔Anti-IRS1抗體、兔Anti-phospho-IRS1(Tyr612)抗體、兔Anti-GLUT4抗體(博奧森)；兔Anti-PI3K p85α抗體(Abcam)；兔Anti-phospho-PI3K p85α(Tyr607)抗體(博歐特)；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(Biosharp)；鹽酸二甲雙胍購買于天津阿爾法生物科技有限公司。倒置相差顯微鏡(CKX41FS，日本奧林巴斯)；酶標儀(MULTISKAN FC，Thermo)；Real time PCR儀(CFX96，Bio-Rad)。

1.2 含藥血清制備

1.2.1 黃連溫膽湯制備 黃連溫膽湯組方為黃連10 g、清半夏15 g、竹茹15 g、枳實15 g、陳皮15 g、茯苓20 g、生姜5 g、甘草10 g，所有飲片購買于黑龍江中醫藥附屬第一醫院草藥局。稱取黃連溫膽湯的所有中藥飲片，生藥量共105 g，加入14倍量的蒸餾水，煎煮3次。每次煮沸后再煎煮1 h，紗布過濾，3次藥液合并，減壓濃縮至稠膏狀，并用凍干機做成凍干粉。用蒸餾水稀釋凍干粉至生藥濃度為2.1 g/mL的藥液(按60 kg人與200 g大鼠體表面積等效劑量折算，終濃度相當于成人給藥量的24倍)。

1.2.2 動物干預及血清制備 取15只SD大鼠，每日灌服黃連溫膽湯凍干粉稀釋液2次，早8時和晚20時各灌胃1次，灌胃后給予適量鼠糧，以模擬臨床中湯劑早飯前、晚飯后的分服。另15只SD大鼠每日灌服等體積蒸餾水。均連續給藥5 d。最后一次灌藥1 h后，戊巴比妥那腹腔注射，麻醉狀態下，仰臥位固定，沿腹正中線逐層打開腹腔，腹主動脈采血，3 000 r/min，離心15 min，分離上層血清，得到黃連溫膽湯含藥血清及空白血清，于-80 ℃存放。

1.3 脂肪細胞的誘導分化 采用經典雞尾酒方法。取5%CO2、37 ℃培養條件下的3T3-L1細胞，待融合度達到100%將培養基換成3 mL誘導培養基A液；3 d后換成2 mL誘導培養基B液；24 h后換回A液；A液和B液更替再重復兩次；用B液維持培養4～7 d。將細胞用10%甲醛固定，加入油紅O染液，異丙醇清洗后顯微鏡下觀察，95%以上呈成熟脂肪細胞表型，細胞內有明顯脂滴，為脂肪細胞誘導成功[5]。

1.4 IR脂肪細胞模型制備 在分化成熟的脂肪細胞中，加入含有1 μmol/L地塞米松的增殖培養基，培養96 h后以葡萄糖消耗量明顯降低，即構建為IR脂肪細胞模型，且36 h內模型穩定[6]。

1.5 黃連溫膽湯最佳干預濃度及時間確定 取IR脂肪細胞，分為四個水平，每個水平設3個復孔，均培養于DMEM高糖+5%FBS培養基，分別給予高劑量中藥(8%含藥血清)、中劑量中藥(4%含藥血清+4%空白血清)、低劑量中藥(2%含藥血清+6%空白血清)、無中藥(8%空白血清)，分別培養12、24和36 h。收集培養板各孔培養液，應用葡萄糖氧化酶法葡萄糖測定試劑盒測定培養液中葡萄糖的含量，計算葡萄糖消耗量。以葡萄糖消耗量明顯升高為依據，最終確定4%含藥血清為最佳干預濃度、36 h為最佳干預時間。

1.6 細胞分組及干預方法 取IR脂肪細胞，隨機分為模型組、黃連溫膽湯組和二甲雙胍組。另取未進行IR造模的脂肪細胞作為正常組。每組各設3個復孔。各組細胞均培養于DMEM高糖+5%FBS培養基，模型組、黃連溫膽湯組和二甲雙胍組分別加入8%空白血清、4%含藥血清+4%空白血清、鹽酸二甲雙胍溶液1 mmol/L，正常組加入8%空白血清。培養36 h。

1.7 PI3K-GLUT4信號通路相關基因檢測 采用TRIzol法提取RNA，Real time qPCR法檢測PI3K-GLUT4信號通路相關基因胰島素受體底物1(IRS1)、PI3K-p85α亞基、葡萄糖轉運蛋白4(GLUT4)mRNA表達。設正常組的mRNA表達量為1，測得各組的閾循環值(Ct值)，計算2-ΔΔCt，分析各基因相對mRNA表達變化。

1.8 PI3K-GLUT4信號通路相關蛋白檢測 采用Western blotting法，檢測IRS1、p-IRS1(Tyr612)、PI3K-p85α、p-PI3K-p85α(Tyr607)、GLUT4蛋白表達。X線膠片蛋白條帶的灰度值結果使用凝膠圖像處理系統進行掃描，磷酸化蛋白的灰度值與其對應蛋白的灰度值之比作為磷酸化蛋白的相對表達量，其余各組蛋白的灰度值與內參GAPDH的灰度值之比作為相應蛋白相對表達量。

2 結果

2.1 各組脂肪細胞葡萄糖消耗量 正常組、模型組、黃連溫膽湯組、二甲雙胍組葡萄糖消耗量分別為(18.863±0.117)、(13.073±0.587)、(16.613±0.947)、(15.867±0.127)mmol/L，模型組葡萄糖消耗量低于正常組，黃連溫膽湯組葡萄糖消耗量高于模型組(P均<0.05)。

2.2 各組PI3K-GLUT4信號通路相關基因表達比較 與正常組比較，模型組GLUT4 mRNA表達下調，黃連溫膽湯組和二甲雙胍組GLUT4 mRNA表達上調(P均<0.05)；與模型組比較，黃連溫膽湯組和二甲雙胍組GLUT4 mRNA表達上調(P均<0.01)；與二甲雙胍組比較，黃連溫膽湯組GLUT4 mRNA表達差異無統計學意義(P>0.05)。各組間IRS1、PI3K-p85α mRNA表達差異均無統計學意義(P均>0.05)。見表1。

表1 各組PI3K-GLUT4信號通路相關基因表達比較[M(P25,P75)]

2.3 各組PI3K-GLUT4信號通路相關蛋白表達結果 與正常組比較，模型組p-IRS1(Tyr612)/IRS1、p-PI3K-p85α(Tyr607)/PI3K-p85α和GLUT4蛋白表達下調(P均<0.05)；與模型組比較，黃連溫膽湯組和二甲雙胍組上述三種蛋白表達水平均上調(P均<0.05)；與二甲雙胍組比較，黃連溫膽湯組上述三種蛋白表達差異均無統計學意義(P均>0.05)。見表2、圖1～3。

表2 各組PI3K-GLUT4信號通路相關蛋白表達比較

圖1 各組p-IRS1 (Tyr612)蛋白表達情況Western blotting法)

圖2 各組p-PI3K-p85α(Tyr607)蛋白表達情況(Western blotting法)

圖3 各組GLUT4蛋白表達情況(Western blotting法)

3 討論

IR和肥胖是引起和組成MS的關鍵因素，控制IR和肥胖的發生進展是改善MS狀態的重要途徑。IR作為MS的主要發病機制，貫穿于MS全過程[7]。脂肪組織是體內最大、最重要的能量儲備系統，是胰島素作用的關鍵靶點，也是糖脂代謝發生的主要場所。因此，如果脂肪細胞發生對胰島素的不敏感甚至抵抗，必然會大幅影響糖脂代謝，其結果就是導致葡萄糖攝取利用減少，葡萄糖堆積剩余[2]。IR與肥胖又互相影響，眾多研究表明，胰島素敏感與否是影響肥胖的重要因素[8]。3T3-L1脂肪細胞由3T3-L1小鼠胚胎成纖維細胞誘導分化而來，當細胞從快速分裂到長滿且接觸抑制時，該細胞系會從前脂肪細胞向脂肪樣細胞逆轉，是常用于建立成熟脂肪細胞模型的細胞系之一。本研究使用3T3-L1脂肪細胞IR模型進行研究，更能代表體內胰島素調節糖脂代謝的進程，模擬MS關鍵因素的糖脂代謝狀態。本研究發現，模型組葡萄糖消耗量低于正常組，說明胰島素抵抗模型建立成功。

胰島素與受體結合后將激活胰島素受體后信號通路，PI3K/Akt是其中重要的一條通路。經過多層的級聯信號傳導，激活下游GLUT4向細胞膜移動完成葡萄糖攝取。如果信號通路受到影響，會導致細胞利用葡萄糖能力下降，進而產生IR，最終導致MS的發生。IRS是PI3K/Akt信號通路上游的重要部分，IRS1是其最主要的異構體[9]，而p-IRS1(Tyr612)則是IRS1的612位點酪氨酸磷酸化的形式，可以理解為是它的活性形式，通過這種活性形式可以將胰島素的信號繼續傳導進入下游通路，所以p-IRS1(Tyr612)占IRS1的比例反映了有效參與傳導胰島素信號的通路蛋白的多少。PI3K由調節亞基p85和催化亞基p110組成[10]，調節亞基p85的表達直接參與糖脂代謝[11]，p-PI3K-p85α(Tyr607)是其607位點酪氨酸磷酸化的形式，p-PI3K-p85α(Tyr607)占PI3K-p85α的比例也反映了傳導胰島素信號的效率。本研究發現，IRS1和PI3K-p85α mRNA水平的表達在黃連溫膽湯含藥血清處理后并未有明顯改變，說明含藥血清調節IR可能不是從轉錄水平進行的。然而，IRS1的Tyr612位點磷酸化蛋白相對IRS1總蛋白表達水平存在差異，與正常組比較，模型組p-IRS1(Tyr612)/IRS1蛋白表達量下調，表明IR-3T3-L1脂肪細胞IRS1的酪氨酸磷酸化減少；黃連溫膽湯組此比值較模型組增多，表明黃連溫膽湯可促進IRS1磷酸化，提高胰島素信號傳導的效率。此外，PI3K-p85α的酪氨酸607(Tyr607)位點磷酸化蛋白相對PI3K-p85α總蛋白表達水平也存在差異，模型組p-PI3K-p85α(Tyr607)/PI3K-p85α下調，表明IR脂肪細胞PI3K-p85α的酪氨酸磷酸化減少，引起胰島素信號傳導障礙。經黃連溫膽湯或二甲雙胍干預，此比值較模型組上調，表明PI3K是黃連溫膽湯改善IR的靶點之一。

同時我們也檢測了此信號通路下游的GLUT4的表達情況，與正常組比較，模型組脂肪細胞GLUT4 mRNA表達下調，同時模型組GLUT4蛋白的表達量也較正常組下降，應用黃連溫膽湯或二甲雙胍干預后，GLUT4 mRNA及蛋白的表達量被上調，表明黃連溫膽湯可上調GLUT4基因表達水平，增強PI3K和GLUT4之間的胰島素信號轉導，改善脂肪細胞IR程度。

黃連溫膽湯是古代名方，出自清代陸廷珍所著《六因條辨》，諸藥合用共奏清熱燥濕、健脾化痰和胃之功，主治膽胃不和，痰熱內擾證之心煩、失眠、胸悶、頭身困重、嘔惡口苦、苔黃膩、脈滑數等。符合MS辨證要點，用之臨證治療MS，可改善各代謝組分療效顯著且毒副作用小，能發揮中醫藥多途徑、多靶點的整體調節優勢。前期基礎研究表明，黃連溫膽湯可降低飲食誘導MS大鼠血壓、血糖、體質量、血脂水平，綜合改善MS各代謝組分[3,12～14]。

在中藥復方的體外藥理作用研究中，直接用藥物進行實驗難以確定發揮藥效的主要成分，因中藥復方成分眾多，但只有通過首關消除后，吸收入血的成分才能繼續發揮藥效，成為藥效物質的基礎(不通過首關消除的藥物除外)，因此口服中藥血清中含有的原型成分、代謝產物、與機體作用形成的新成分，才可能是真正的有效成分。而且離體反應系統無法替代真實的體內環境，經過復雜的體內吸收代謝過程，一些原藥成分可能會發生理化變化[15]。故本實驗采用含藥血清方法來代表藥物體內過程，以進一步進行認定、分離體內移性成分，從體內直接作用化學成分的角度確定黃連溫膽湯改善IR的藥效物質基礎[16]。本研究發現，黃連溫膽湯組葡萄糖消耗量高于模型組，提示含藥血清確能顯著增加脂肪細胞的葡萄糖消耗量，表明黃連溫膽湯血清對IR有明顯的改善作用；經黃連溫膽湯含藥血清干預后， PI3K、IRS和GLUT4的蛋白活性部分均較模型組增高，且GLUT4 mRNA表達水平也較模型組上調，說明黃連溫膽湯改善IR是通過PI3K-GLUT4信號通路進行的。

綜上所述，黃連溫膽湯含藥血清可有效改善鼠脂肪細胞的IR，其機制可能是通過PI3K-GLUT4信號通路實現的。