在線固相萃取凈化-離子色譜法測定煙草中的糖

張 濤，曾婉俐，向海英，張承明，李 晶，李雪梅，楊光宇，張建鐸

(云南中煙工業有限責任公司 技術中心，云南 昆明 650106)

糖類化合物是煙草中的重要成分，對煙草的生長發育和成品煙葉的內在質量均有重要影響。煙草樣品中含有多種糖，但葡萄糖、果糖和蔗糖占煙草中水溶性總糖含量的90%以上。因此煙草中葡萄糖、果糖和蔗糖的測定，對了解煙草的生長發育情況及成品煙葉品質的評價均具有重要意義[1]。目前，關于煙草中水溶性糖的測定文獻報道很多，主要有方法有滴定法、近紅外光譜法、連續流動分析法、毛細管電泳法、氣相色譜法、高效液相色譜法和離子色譜法等[2-4]。

離子色譜法可以無需衍生直接進行檢測低濃度糖的定量分析，幾乎能分析所有的單糖和大部分的低聚糖，樣品前處理操作簡單，因此該技術在水溶性糖分析中得到了廣泛應用[3,5-7]。目前，煙草行業標準YC/T 251─2008采用離子色譜法測定煙草中葡萄糖、果糖和蔗糖[7]。但樣品分析時間長(每個樣品的色譜分析時間需40 min左右)；而且樣品前處理采用萃取液不經凈化直接進樣，大量樣品分析時萃取液中的干擾成分容易在離子色譜柱上富集而污染色譜柱并影響分析結果。隨著煙草行業煙草基因編輯工廠化育種工作的啟動，通過基因編輯將產生數萬個素材，需對這些海量的素材進行快速化學分析評價，現有行業標準很難滿足這些海量素材快速篩選化學分析的需求。為了尋找更簡便、快速的分析方法，筆者研究了在線固相萃取凈化-離子色譜法測定煙草中葡萄糖、果糖和蔗糖的方法。通過色譜柱和色譜條件的優化，每個樣品的色譜分析時間可縮短到10 min。通過在離子交換柱前增加反向樹脂在線凈化柱，可有效地在線除去樣品萃取液中的小極性干擾成分，避免了這些成分污染色譜柱而影響分析結果。為了進一步簡化樣品前處理，筆者還通過自主設計的樣品萃取瓶，可不經樣品轉移就可完成樣品的萃取和萃取液的過濾，使樣品前處理周期也大大縮短。改進的方法與目前行業標準相比，日樣品分析量可提高3倍以上。該方法的建立為基因編輯素材化學篩選提供了快速、準確、可靠的高通量分析方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

ICS-3000多功能離子色譜儀(美國戴安公司)，包括雙泵、自動進樣器，安培檢測器和Chromeleon 6.8色譜工作站；安培檢測器工作電極為金電極，參比電極為pH/Ag/AgCl和鈦對電極。

葡萄糖、果糖、蔗糖標樣(瑞士Fluka公司生產，純度均大于99%)。

葡萄糖、果糖、蔗糖標準溶液的制備：分別準確稱取50 mg的果糖、葡萄糖、蔗糖和麥芽糖于10 mL容量瓶中，用50%甲醇溶解并定容到刻度，得到5.0 mg/mL的單標儲備液；使用時分別取單標儲備液用水稀釋成所需濃度的混合標準工作液。

氫氧化鈉為優級純(北京化學試劑公司)；實驗用水為高純水(用Milli-Q50高純水處理器)。

改進的樣品萃取瓶見圖1，樣品萃取瓶由帶密封圈的外套管(圖1-a)和帶0.45 μm過濾篩板的內套管(圖1-b)組成。

圖1 改進的樣品萃取瓶

1.2 色譜條件

色譜柱為CarboPac PA1(4×250 mm，5m)碳水化合物分析柱，在離子色譜柱前接MCI-GEL反向樹脂填料的在線固相萃取柱(4×10 mm，5 μm)；流動相為0.20 mol/L的氫氧化鈉溶液，流速1.5 mL/min。PAD脈沖安培檢測器(Au工作電極)，工作電位如下：0.00～0.40 s，0.1 V；0.41～0.42 s，-2.0 V；0.43 s，0.6 V；0.44～0.50 s，-0.1 V；積分區間為0.20～0.40 s。進樣2.0L。

1.3 樣品處理

新鮮煙葉冷凍干燥、成品煙葉樣品烘箱中40 ℃烘干，然后粉碎并過40目篩。把樣品萃取瓶外套管(圖1-a)放到不銹鋼試管架上。準確稱取樣品0.1 g于外套管中，用50 mL的移液槍在裝有樣品的套管中加入50 mL的水，然后把萃取瓶的內套管卡在外套管的口部(圖1-c)。裝好后把帶樣品瓶的試管架放到恒溫超聲波水浴鍋中于50 ℃下超聲萃取20 min。萃取完后把萃取瓶的內套管向下壓，萃取溶液就通過過濾篩板進入到內套管中，并從內套管中的細彎管流出，到達樣品過濾的效果(圖1-d)。從細彎管口收集萃取液，棄去最初的2～3 mL，然后用色譜進樣瓶直接收集1.0～1.5 mL的樣品萃取液冷卻到室溫，供離子色譜分析用。

2 結果與分析

2.1 樣品處理條件

煙草樣品中水溶性糖一般采用水或80%的甲醇水溶液提取；與用有機溶劑提取相比，用水提取成本低且環境污染小，煙草行業標準YC/T 251─2008中也采用水萃取樣品；因此本實驗選擇用水為萃取溶劑。常用的萃取方法有勻漿法、振蕩萃取法和超聲萃取[5]；高速勻漿法效率高，但每次只能處理1個樣品；而超聲和震蕩萃取可一批樣品(數十個樣品)同時處理，樣品量大前處理效率更高。超聲萃取與震蕩萃取比較，超聲萃取的效率明顯高于震蕩萃取，因此本實驗選用震蕩萃取。實驗結果表明：提高溫度有利于提高樣品中糖的溶出，縮短萃取時間；每0.1 g的樣品用50 mL的水提取，在室溫下需超聲30 min左右，樣品中的糖才能完全溶出；但在50 ℃左右超聲萃取15 min，樣品中的糖就可完全溶出，繼續延長萃取時間對分析結果無明顯影響。因此本實驗中選擇在50 ℃左右超聲萃取20 min。

另外，在萃取煙草中的水溶性糖時，少量的蠟質，色素、多酚、脂肪類物質等物干擾成分也有可能轉移到萃取液中，這些成分不能被離子色譜的流動相洗脫，容易在色譜柱上殘留而污染色譜柱，進而影響分析結果。蘇軼[8]、王璐[9]等采用C18固相萃取凈化樣品并取得較好的分析效果；但固相萃取的引入增加了樣品前處理操作步驟。為了簡化樣品操作步驟，本實驗選擇在離子色譜柱前接MCI-GEL反向樹脂填料的在線固相萃取柱；MCI-GEL反向樹脂基體是聚苯乙烯和二乙烯基共聚物，與C18具有相似的保留行為，但使用的pH范圍比C18寬，在pH 0～14范圍內均可穩定使用，因此特別適合在離子色譜的堿性流動相下使用；而且可不經活化直接固相萃取[10-11]。實驗結果表明：該固相萃取柱具有好的除去小極性干擾成分的效果，而且離子色譜分析進樣量小(每次僅2.0 μL)，4×10 mm在線固相萃取柱的萃取容量在30 mg以上，連續進樣分析500次以上，萃取柱上積累的干擾均不會超過萃取柱的容量；隨著進樣次數的增加，色譜系統的反壓有明顯升高后用甲醇沖洗固相萃取柱后即可恢復到初始壓力。該在線固相萃取柱的使用簡化了文獻[8-9]中報道的樣品前處理過程中的固相萃取操作，對離子色譜柱起到很好的保護作用。

考慮YC/T 251─2008方法樣品前處理的樣品萃取和過濾過程中需轉移樣品，操作麻煩。本研究中通過對樣品萃取瓶的改進，設計了快速樣品前處理方法。在該處理方法中樣品萃取瓶由帶密封圈的樣品管(圖1-a)和帶固相萃取填料(C18)的內套管(圖1-b)組成，準確稱取樣品置于帶密封圈的樣品管中，然后加入萃取液，把內套管卡在樣品管的口部(篩板不接觸到液面)防止超聲萃取過程中萃取液濺出或超聲波中的水濺入，把樣品管放恒溫超聲水浴鍋中超聲萃取，萃取完后把內套管下壓，萃取液就通過篩板和固相萃取填料進入到內套管中，并從內套管的細彎管中流出，從細彎管口收集經篩板過濾的萃取液，棄去最初的2～3 mL，然后用色譜進樣瓶直接收集1.0～1.5 mL的萃取溶液，即可供離子色譜分析。

在改進的方法中，整個操作流程不需要轉移樣品，樣品前處理過程得到了大大的簡化。由于在震蕩萃取前用內套管卡住樣品杯的口部，有效防止了在震蕩萃取過程中可能造成的萃取液濺出的風險。另外，按常規方法樣品前處理操作時，在用針頭過濾器過濾過程中，煙草細粉會堵塞過濾頭，過濾速度較慢；而在改進的處理方法中，超聲萃取完成后稍加放置，煙草樣品粉末就沉到底下，過濾時內套管中的篩板只與上層清夜接觸，這樣可有效地避免過濾過程中的篩板堵塞，過濾速度更快，過濾操作更容易實現。

2.2 色譜條件的選擇

對于煙草中葡萄糖、果糖和蔗糖的測定，可選擇的離子色譜柱有戴安CarboPac PA1、CarboPac PA10、CarboPac PA20柱以及萬通METROSEPCARB-1等，其中CarboPac PA1色譜柱分離時間短，因此實驗選用該色譜柱。CarboPac PA1色譜柱屬于陰離子交換柱，一般采用氫氧化鈉溶液為流動相，隨流動相中氫氧化鈉濃度增加，各成分在色譜柱上的保留時間縮短，但分離度下降；反之，隨流動相中氫氧化鈉濃度降低，各成分分離度有增加，但在色譜柱上的保留時間延長，結合時間和分離度綜合考慮，本實驗選擇用0.2 mol/L的氫氧化鈉溶液為流動相。另外，說明書中推薦流速為1.0 mL/min，適當加快流速可縮短分析時間，但流速過高會存在壓力超過色譜系統反壓設定上限的風險，流速在2.0 mL/min以下色譜系統壓力均不會超壓。考慮到隨著使用次數的增加，色譜柱上微量雜質吸附會導致系統反壓緩慢增加，因此本實驗中選擇流速為1.5 mL/min。

加大樣品進樣量有利于提高分析靈敏度，但進樣量過大時色譜峰會稍有變寬而影響分離度；考慮到煙草樣品中糖含量相對較高，進樣2.0 μL時分析靈敏度已能滿足實際樣品分析的要求，因此本實驗中選擇進樣體積為2.0 μL。

脈沖安培檢測器是通過測量電化學活性物質在適當的施加電位下發生氧化或還原反應時所產生的電流變化，從而測定該物質的一種檢測器。由于糖的分離是在堿性條件下完成，而脈沖安培檢測器金電極的檢測條件通常為堿性，金電極表面可為糖的電化學氧化反應提供反應環境，金電極檢測和陰離子交換分離相互間具有良好的匹配性，非常適合用于糖類化合物的檢測。因此本實驗中參照胡靜等[12]采用的脈沖安培檢測器檢測糖。

在選定實驗條件下，標樣和實際樣品的色譜圖見圖2。從圖2可以看出，葡萄糖、果糖和蔗糖均可達到基線分離，而且整個色譜分離時間只需10 min。

1.葡萄糖、2.果糖、3.蔗糖圖2 標樣(a)和煙草樣品(b)色譜圖

2.3 工作曲線與檢出限

配制系列不同濃度的標準溶液，在選定色譜條件下進樣1.0L，根據測得的峰面積A(單位為mV·s)對糖的濃度(mg/L)進行線性回歸，得到回歸方程。再將最小濃度的標準溶液逐級稀釋，依次進樣10L，計算當信噪比S/N=3時所對應的標準溶液的濃度以確定檢出限，計算當信噪比S/N=3時所對應的標準溶液的濃度以確定定量限。從表1可以看出，各待測組分均具有很好的線性關系，線性范圍能覆蓋煙草樣品中3種糖的實際含量。

表1 回歸方程、相關系數、線性范圍和檢出限

2.4 精密度實驗

取煙草樣品在相同條件下平行測定7次(同批次處理)，并計算7次平行測定結果的相對標準偏差，可得葡萄糖的RSD為2.0%、果糖的RSD為1.8%、蔗糖的RSD為2.3%，說明該方法的精密度良好。取相同煙草樣品在不同時間內測定(每天測定1次，共7次)，計算7次測定結果的相對標準偏差，可得葡萄糖的RSD為2.3%、果糖的RSD為2.2%、蔗糖的RSD為2.5%；說明在不同時間內測定，該方法的精密度仍然良好。

2.5 回收率實驗

為驗證方法的準確性，在2個煙草的樣品中各加入相對于爆珠重量5.0、10.0、20.0 μg/g標樣，分別進行萃取和HPLC分析，并根據測定量、加入量和原含量計算加標回收率。甲醛和乙醛的回收率見表3。從表3可以看出，3種糖的回收率均在93.2%～104.6%之間，說明該方法具有很高的回收率。

表2 方法回收率實驗結果

2.6 樣品分析結果

采用本方法與煙草行業標準方法YC/T 251─2008[7]對5個煙葉樣品進行測定。由表3可知，采用本方法的測定結果與YC/T 251─2008的分析結果具有較好的一致性，說明該方法準確可靠。

表3 5種煙葉樣品中糖的測定結果

3 結論

本研究針對目前煙草行業標準YC/T 251─2008測定糖時，其分析周期長、樣品前處理操作麻煩，很難滿足基因編輯工廠化育種工廠中產生的海量素材快速分析的需求。對在線固相萃取凈化-離子色譜法測定煙草中的糖進行了研究。通過色譜柱和色譜條件的優化，每個樣品的色譜分析時間可縮短到10 min。通過在離子交換柱前增加反向樹脂在線凈化柱，可有效地在線除去樣品萃取液中的小極性干擾成分，避免了這些成分污染色譜柱而影響分析結果。為了進一步簡化樣品前處理，筆者還通過自主設計的樣品萃取瓶，可不經樣品轉移就可完成樣品的萃取和萃取液的過濾，使樣品前處理周期也大大縮短。改進方法和目前行業標準相比，日樣品分析量可提高3倍以上；而且該方法的精密度、回收率均可滿足煙草樣品分析的需求。通過實際樣品分析結果和行業標準方法進行對比，3種糖的分析結果均和煙草行業標準的測定結果相符合。該方法的建立為基因編輯素材化學篩選提供了快速、準確、可靠的高通量分析方法。