柑橘四倍體田間化學誘導技術研究

萬水林,劉召亮,胡鐘東,閆承璞, DUAN Xian-ming,王雨亭

(1.江西省農業科學院 園藝研究所,江西 南昌 330200;2. Bay Food Tech. CA, 95129, USA)

當前我國柑橘生產中,大部分栽培品種有核,不受消費者歡迎;有些柑橘主栽品種因品質較差,在市場上缺乏競爭力;還有一些地方良種在國內外新品種不斷出現的今天,其傳統優勢逐漸失去,優勢不再。因此對柑橘有核品種進行無核化改良,提升栽培品種和地方良種的品質,開展柑橘倍性育種很有必要。而要進行倍性育種,首先必須開展多倍體的誘導研究,從而為柑橘倍性雜交提供四倍體親本。四倍體的產生方式包括自然發生和人工誘導兩種。陳全友等在蘇北灌云縣發現了1株自然四倍體的枳幼樹[1],這種自然四倍體的發生概率極低,一般均從實生種子中篩選獲得。美國農業部通過對種子幼苗外部形態特征的鑒別,獲得了多個柑橘種類的同源四倍體[2];借助流式細胞儀,西班牙從苗床中篩選出30多株自發性同源四倍體[3];華中農業大學根據幼苗形態觀察結合流式細胞儀檢測,從枳等10個砧木類型的實生種子幼苗中發現了部分四倍體[4],從早金甜橙等9個品種的實生后代中篩選出了部分同、異源四倍體和同、異源三倍體[5]。人工誘導為獲得四倍體的主要方式,陳大成等(1985)采用田間活體誘導方式,用秋水仙素處理柑桔栽培品種嫁接苗,獲得了同源四倍體,并在其中發現一個有希望作為經濟栽培的四倍體柑桔類型——同源四倍體十月桔[6]。由于進行活體誘導時無法保證細胞的分裂同步,因此活體誘導較難得到純合四倍體植株,大多為嵌合體,且誘導率低。隨著生物技術的發展,多倍體大多是通過組織培養、生物技術等離體培養方式獲得的,例如：劉繼紅等采用電融合方法誘導澳洲指橘,獲得了柑橘屬間四倍體體細胞雜種[7];洪柳等通過組培方法對椪柑種子進行培養,獲得了7株四倍體植株[8];美國Grosser等[9]、Viloria等[10]先后采用原生質體融合技術,獲得了柑橘體細胞雜種;西班牙Pablo Aleza等采用組培砧苗,用微芽嫁接結合秋水仙素誘導處理獲得了柑橘四倍體[11];何建等用胺磺靈浸泡椪柑莖段,獲得了椪柑四倍體[12]。

目前,對柑橘多倍體的誘導研究大都集中在組織培養等離體誘導方法上,該方法在實驗室內進行,易于控制,誘導率較高；而對田間活體誘導研究較少。但采用田間活體誘導方式,操作簡單,無需煉苗,誘導成功后可快速投入應用。由于柑橘種類較多,不同的柑橘種類之間樹勢、枝梢和芽的外部形態及組織結構特征均有較大差異,因而對所需的誘導藥劑及其使用濃度等可能存在差別,因此,我們開展了柑橘四倍體田間化學誘導技術的試驗研究,以便為柑橘田間多倍體的高效誘導提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為江西目前栽培較多的柑橘品種,包括南豐蜜橘、新余蜜橘、椪柑、金沙柚以及文旦柚。試驗在江西省農業科學院園藝研究所試驗基地進行。

1.2 試驗方法

1.2.1 誘導藥劑 選用目前對植物四倍體誘導效果最佳的秋水仙素(Colchicine)[100 mg/支,由生工生物工程(上海)股份有限公司生產]、氨磺樂靈(Oryzalin)(100 mg/支,由美國Sigma-Alorich公司生產)、氟樂靈(Trifluralin)(250 mg/支,由美國Sigma-Alorich公司生產)。

1.2.2 藥劑配制 將秋水仙素直接用水溶解,按要求配制成0.025%～0.200%的溶液；配制好后,再加入1%DMSO(二甲基亞砜),待用。在室溫下將0.1 g氨磺樂靈溶于0.5 mL丙酮溶劑,溶解過程中加蓋防揮發；再加入1 mL乙醇,混勻后再加入0.2 mL吐溫-20,充分混合；最后用丙二醇定容至2 mL,配制成5%的氨磺樂靈母液；試驗前再配制成各種所需的濃度。將0.1 g氟樂靈用0.4 mL二甲基亞砜溶解后,再用60 ℃左右的溫水稀釋至所需的不同濃度。

1.2.3 處理方法 在2015年,以0.05%、0.10%、0.15%和0.20%的秋水仙素進行新余蜜橘活體芽的誘導效果比較;不同柑橘品種間的誘導效果比較統一采用0.15%的秋水仙素。在2016年，以0.025%、0.05%、0.075%和0.10%的秋水仙素進行新余蜜橘誘導效果的比較;不同柑橘品種間的誘導效果比較統一采用0.05%的秋水仙素溶液。在2017年,采用0.10%的處理濃度,進行了同一濃度條件下不同藥劑田間誘導的比較試驗。

活體芽誘導處理方法:在2015年3月春芽發芽前,選枝條中上部腋芽,用棉球飽和吸取事先配制好的處理溶液,置于已剪去葉片的腋芽上,然后用parafilm封口膜將棉球和腋芽密封包裹,做好標記,10 d后,去掉包裹。2016年的試驗則在2015年試驗研究的基礎上進行了改進,除降低了秋水仙素的使用濃度外,為保持處理部位相對穩定的溫度環境,保持藥劑的穩定性,在用封口膜包好后,外部再用黑色膠布包裹。2017年的處理方法同2016年。

1.3 倍性檢測

在處理1個月后,檢查處理芽的發芽情況。在處理2個月后,用德國Partec公司生產的CyFlow PA型流式細胞儀檢測葉片的染色體倍性。

2 結果與分析

2.1 不同濃度秋水仙素處理對新余蜜橘發芽率的影響

用不同濃度的秋水仙素誘導新余蜜橘活體芽時,秋水仙素對芽的正常萌發有一定程度的影響,結果見圖1。發現以0.05%的秋水仙素處理時發芽率最高,為81.20%;用0.20%的秋水仙素處理時發芽率最低,為25.00%。隨著秋水仙素使用濃度的提高,柑橘的發芽率明顯下降,說明秋水仙素對柑橘芽的萌發有抑制作用,而且隨著秋水仙素使用濃度的增加,抑制作用增強。

圖1 不同濃度秋水仙素對新余蜜橘發芽率的影響(2015年)

2.2 不同濃度秋水仙素對新余蜜橘四倍體的誘導效果

連續兩年的試驗結果(表1和圖2)表明,對新余蜜橘活體芽四倍體誘導效果最佳的秋水仙素處理濃度為0.10%，在該濃度條件下,2015年新余蜜橘四倍體的誘導率達13.43%,2016年新余蜜橘四倍體的誘導率達14.29%。秋水仙素使用濃度過高或過低均會降低四倍體的誘導效果。

2.3 秋水仙素對不同柑橘品種的四倍體誘導效果

2015年誘導比較試驗結果顯示,經秋水仙素處理后,不同柑橘品種間的發芽率和四倍體的誘導效果差異均較大,以新余蜜橘的發芽率最高,為36.00%;以南豐蜜橘的四倍體發生率最高,為5.00%(表2)。

表1 不同濃度秋水仙素對新余蜜橘四倍體誘導效果的影響

注：表頭中的百分數為秋水仙素使用濃度。4X指四倍體，2X指二倍體，下同。

圖2 流式細胞儀倍性檢測結果(左圖為二倍體;右圖為四倍體)表2 0.15%秋水仙素對不同柑橘品種四倍體的誘導效果(2015年)

項目新余蜜橘南豐蜜橘溫州蜜柑文旦柚處理芽數/個50404927發芽數/個1811112發芽率/%36.0027.5022.457.414X數/個12104X發生率/%2.005.002.040.00

在2015年的試驗中,采用的秋水仙素處理濃度為0.15%,四倍體誘導率較低,最高的南豐蜜橘四倍體的誘導率也僅為5.00%。因此，在2016年的試驗中降低秋水仙素的使用濃度至0.05%,結果(表3)表明：除新余蜜橘四倍體的誘導率較低外,其它柑橘品種的誘導率均較高,其中南豐蜜橘的誘導率高達42.86%；另外，秋水仙素處理濃度降低后,各柑橘品種的發芽率未受到藥劑影響,均達到100%。

表3 0.05%秋水仙素對不同柑橘品種四倍體的誘導效果(2016年)

2.4 不同處理藥劑對柑橘四倍體的誘導效果

采用秋水仙素、氨磺樂靈和氟樂靈分別對新余蜜橘進行田間四倍體誘導試驗,處理濃度均采用0.10%,將試驗效果列于表4。結果表明：在3種誘導藥劑中,對新余蜜橘四倍體誘導效果最佳的藥劑為秋水仙素,誘導率為30%；其次為氨磺樂靈,誘導率為7.69%；而氟樂靈無誘導效果。

表4 不同處理藥劑對柑橘四倍體的誘導效果(2017年)

3 討論

秋水仙素已被證實是誘導植物多倍體的最為有效的藥劑,它對細胞分裂活躍狀態的組織具有有效的刺激作用,可使分生組織的染色體加倍,所以它常被用于處理種子、子葉、生長點等部位[13-14]。前人研究表明,組織培養等離體方式的多倍體誘導效果與使用的具體誘導劑的濃度和處理時間以及植物種類、器官和溫度等有關,使用濃度過高、處理時間過長會使植物受到傷害；而濃度過低、時間過短又起不到很好的誘導效果[15-16]。在本研究中,所選用的柑橘材料為剛萌發的腋芽,是因為其細胞分裂旺盛,有利于對藥劑的吸收。在2015年試驗中由于使用的秋水仙素濃度過高,明顯影響了柑橘的發芽。在2016年,降低秋水仙素的使用濃度至0.05%,結果發芽率均達到100%,而且四倍體的誘導率也得到了極大的提高。

用秋水仙素處理植株時,還要注意對溫度條件的控制,低溫會阻礙細胞分裂,過高的溫度則會使秋水仙素對細胞的損害加大,同時也會加速秋水仙素的變性。在2016年試驗中,用封口膜密封后,外部再用黑色膠布包裹,有效防止了陽光直射引起的溫度過高,避免或減輕了藥劑傷害,經秋水仙素處理后各柑橘品種的發芽率均未受到任何影響。

除草劑氨磺樂靈、氟樂靈具有低的毒性和良好的多倍體誘導效果，在多種植物上已得到應用[17-19]；用氨磺樂靈也成功誘導離體柑橘外植體獲得了四倍體材料[11-12]。但本研究發現,氨磺樂靈對柑橘田間活體芽多倍體的誘導效果不如秋水仙素,這與氨磺樂靈在組織培養條件下的誘導結果[11,20]類似。

前人的相關研究表明,多倍體誘導中的嵌合體嚴重是多倍體育種中的難點[21-22]。Aleza用0.1%的秋水仙素和0.1%的氨磺樂靈分別對離體克里曼丁等橘類的腋芽誘導后進行微芽嫁接,四倍體的誘導率分別為15%和33%；秋水仙素誘導的四倍體存在一定比例的嵌合體,但產生的四倍體較氨磺樂靈誘導的生長更快[23]。而我們的研究發現,采用相應的處理技術后,嵌合體的發生率并不高,2015年只發現有極少量嵌合體發生,2016年則未檢測出嵌合體,均為純四倍體,可能與選擇了適宜的誘導時期和創造了有利的誘導條件有關。

4 結論

本研究結果表明：對柑橘田間活體芽誘導四倍體效果最佳的藥劑為秋水仙素,其適宜的處理濃度為0.10%；氨磺樂靈和氟樂靈的誘導效果較差;秋水仙素對不同柑橘品種發芽率和四倍體誘導率的影響均存在較大的差異,以新余蜜橘的發芽率最高,以南豐蜜橘的四倍體誘導率最高;進行田間活體誘導時,輔以適宜的技術措施,可大大提高發芽率,并降低嵌合率。