鐵皮石斛自交和雜交親和性的細胞學研究

高 楊，林韌安，袁超群，馬麗婭，王佳囡，朱玉球，高燕會

（1.浙江農林大學 省部共建亞熱帶森林培育國家重點實驗室，浙江 杭州 311300；2.浙江省樂清市林業良種科技中心，浙江 樂清 325600）

鐵皮石斛Dendrobium officinale又名黑節草，屬蘭科Orchidaceae石斛屬Dendrobium多年生附生草本植物，主要分布于中國安徽、浙江、福建、云南、四川等省和華南某些地區，具有抗腫瘤、抗衰老、增強機體免疫力、降血糖和有效減輕肝損傷等作用［1－3］，被譽為 “中華九大仙草”之首，國際藥用植物界的 “藥界大熊貓”［3］。對鐵皮石斛種質資源的保存研究發現，鐵皮石斛自交結實率較低，甚至不結實，其優良品種只能通過種內雜交或者無性繁殖才能保存。因此，深入研究鐵皮石斛自花不育機制，廣泛開展種內種間雜交育種是實現鐵皮石斛種質保存以及種質資源創新的有效手段。近年來，有關鐵皮石斛花粉活力［4］、 雜交育種［5］、 栽培技術［6］及化學成分［7］等的研究較多， 但涉及鐵皮石斛自交和雜交親和性細胞學基礎和機制方面的研究甚少。與眾多顯花植物一樣，鐵皮石斛在長期進化過程中形成了自交不親和的生殖隔離機制，表現為雌雄蕊發育正常且同熟，自花或同基因型異花傳粉后卻不能結實［8］。對顯花植物自交不親和性的研究一直是植物界的研究熱點之一，十字花科Cruciferae［9-10］，罌粟科Papaveraceae［11］，紫葳科Bignoniaceae［12］，薔薇科Rosaceae［13］等植物的自交不親和性的細胞學和分子遺傳學研究已較為深入。石斛屬植物自交不親和性的研究雖已有報道［14-15］，但關于鐵皮石斛自交不親和性尚不確定。為了進一步了解鐵皮石斛自交和雜交親和性生物學機制，本研究對自交（自花授粉）和種內雜交的樣品進行細胞學觀察，考察自交和雜交后花粉管的生長情況，為鐵皮石斛的自交不結實現象的類型和機制研究、種質資源保育、雜交育種及新品種選育提供細胞學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用 8 個 鐵皮石斛 親 本 材 料 分 別 為 78×69， 17×163， 124×30， 18×22， 13×163， 966，C13，6A2B。栽培于天目山鐵皮石斛示范種植基地，為設施栽培，栽培基質為松樹皮。各材料隨機選擇生長健壯并正常開花的200朵花分別進行自交（自花授粉）和種內雜交（正交和反交），重復3次。

1.2 試驗方法

1.2.1 花粉生活力測定 于2016年5-6月盛花期采集8種鐵皮石斛的新鮮花粉，采用聯苯胺法［16-17］測定親本的花粉生命力。觀察5視野·材料-1，觀察花粉數量≥30個·視野-1，重復3次。花粉萌發率=萌發花粉數/觀察花粉數×100%。

1.2.2 自交和種內雜交 選擇莖稈粗壯且分節明顯、無病蟲害的鐵皮石斛植株作為親本，于開花的第3～5天，選擇200朵·親本-1，進行自交和雜交試驗。自交花粉來自同株自花或異花成熟花粉，雜交時去掉母本雄蕊，夾掉唇瓣，去除藥帽，用鑷子將花粉團送入母本柱頭內進行授粉［18］。授粉后注明親本和授粉時間，用于花粉管熒光顯微觀察和坐果率的統計。

1.2.3 花粉管萌發觀察及生長測定 分別于授粉后1，2，4，8，12，24，48，72和96 h，采集雌蕊，15 朵·樣品-1， 甲醛-冰乙酸-乙醇（FAA）固定液［V（70%乙醇）∶V（冰乙酸）∶V（甲醛）=90∶5∶5］固定， 4 ℃冰箱保存備用［19-20］。采用脫色苯胺藍熒光染色技術［11］測定花粉管萌發及生長情況。在常溫下，用8 mol·L-1氫氧化鈉（NaOH）溶液軟化脫色2 h，然后用質量分數為0.5%的苯胺藍溶液染色6 h，再用甘油壓片；分別在萊佧顯微鏡（Leica DM 4000，德國）明視場和熒光模式紫外光激發狀態下觀察和拍照。樣品經FAA固定、氫氧化鈉處理及蒸餾水清洗等過程，簡單附著在柱頭的花粉將會被洗掉，因此最終留在柱頭上的花粉可視為萌發。花粉管熒光觀察時分別采用未授粉染色和未染色的雌蕊為對照，比較花粉管萌發和花粉管生長情況。

2 結果與分析

2.1 花的結構

鐵皮石斛花為總狀花序、唇型花。花瓣與萼片均為乳黃綠色，其中1枚花瓣變異為唇瓣；雌蕊與雄蕊合為一體形成典型的合蕊柱，雌蕊位于下方，雄蕊在上方，中間有隔膜將兩者隔開；隔膜下方有1個柱頭窩，上方為藥室，藥室有1個藥帽覆蓋［20］；花粉粒呈乳黃色水滴狀，4粒，兩兩連在一起形成2個花粉塊。花結構如圖1所示。

2.2 親本花粉生活力測定

采用聯苯胺法［17］測定花粉生命力。結果發現：8個親本的花粉生活力均高于88.0%（圖2），說明試驗材料的花粉活性均較高，符合后續研究需要。

2.3 花粉管的萌發和生長

圖1 鐵皮石斛花的結構Figure 1 Flower structure of Dendrobium officinale

鐵皮石斛花粉授到柱頭上后，隨即開始水合并萌發，長出花粉管。花粉管通過乳突細胞間隙和乳突細胞進入柱頭，進而匯集到花柱道中，經花柱道內表皮腺細胞分泌的黏液層向下生長［14］。對柱頭染色處理可見：花粉管在熒光的激發下呈現藍綠色熒光，可以觀察到花粉粒在柱頭上的萌發和花粉管的生長情況。顯微觀察發現：鐵皮石斛花柱道中空，花柱從上到下呈現出花柱道逐漸貼合的趨勢；自交和雜交花粉管都匯集在一起沿著兩壁縱向生長（圖 3A）。

自花授粉交與雜交授粉對花粉粒在柱頭的萌發情況無明顯差異。授粉1 h內，花粉管生長速度極快。1 h后伸長變緩，此時花粉管生長到花柱基部并接近子房，花粉管中均能觀察到精核細胞，但是雜交處理的精核數量遠遠超過自交（圖3B，圖3C）。由于花粉管匯集在一起且縱向生長，從形態上看自交與雜交處理未見明顯差異（圖3D，圖3E）。授粉后約2 h，花粉管生長到達花柱基部，此時發現雜交后的花粉管繼續向子房生長，而自交后的花粉管在花柱基部生長減緩，部分生長停滯（圖3F），只有少數能夠進入子房。不同的鐵皮石斛親本花粉管的生長速度也略有不同。

圖2 不同鐵皮石斛親本花粉萌發率Figure 2 Determination of pollen viability of differentDendrobium officinale cultivars

圖3 鐵皮石斛自交和雜交后花粉管在花柱中的生長情況Figure 3 Growth of pollen tube in the style of self pollination and hybridization of Dendrobium officinale

2.4 花粉管在子房中的生長特性

花粉管伸長進入子房后，在側膜胎座內繼續生長。觀察發現，自交授粉后的2～4 h，花粉管生長緩慢，只有少數進入子房內部（圖4A）；雜交授粉4 h后，大量花粉管呈束狀進入子房，沿胎座空隙向子房底部生長（圖4B）。由此認為，自交與雜交處理盡管在花粉管進入子房的時間上差異不顯著，但數量明顯少于雜交。此后1 d內，自交處理多數花粉管停留在花柱基部與子房連接的上下區域緩慢生長，即便有少數能夠進入子房，長到一定長度后最終也停止生長，未能達到子房底部（圖4C）；雜交處理花粉管在繼續沿子房緩慢向下生長（圖4D），并在授粉后48 h生長至子房1/3處（圖4E），直至授粉96 h，子房內依舊有大量的花粉管，子房表現為飽滿（圖4F）；而自交處理的花粉管數量在48 h后明顯減少，子房的飽滿度較低（圖4G），授粉后96 h，花柱內的花粉管基本都消失，子房也出現嚴重的萎縮現象（圖4H）。由此推測，鐵皮石斛自交不能結實可能是由于某種自身的機制導致精核無法到達胚珠完成受精而造成。

圖4 鐵皮石斛自交和雜交花粉管在子房中的生長Figure 4 Growth of pollen tube of self pollination and hybridization in Dendrobium officinale

2.5 自交和雜交結實情況

于2016年6月和10月分別對鐵皮石斛自交和雜交坐果率進行統計（表1）。相同條件下，鐵皮石斛親本自交的坐果率均為0，而種內雜交坐果率普遍為60.0%～96.0%，大部分正交和反交的坐果率相差不大，僅有6A2B和18×22作為親本時正反交坐果率差異較大，分別為94.8%和29.5%，這可能與親本之間的親和力有關。

表1 鐵皮石斛種內雜交坐果率Table 1 Percentage of fertile fruit of Dendrobium officinale interspecific hybridization

3 討論

受到花粉與柱頭、花粉管與花柱及雌雄配子體之間識別作用的限制，植物自交和雜交親和性障礙主要發生在花粉粒的萌發，花粉管進入柱頭，花粉管通過花柱和受精、胚發育等階段，每個階段的障礙均可能引起自交和雜交的不親和［21］。本研究發現，種內雜交坐果率普遍為60.0%～96.0%，少數親本種間雜交坐果率為29.0%～34.0%，8個品種自交坐果率均為0，說明鐵皮石斛花朵種內雜交能良好進行，但其自交無法產生后代，可以認為鐵皮石斛具有自交不親和的特性。

自交不親和是在受精過程中發生的主動識別和拒絕自交花粉的機制，根據植物花型的不同，自交不親和性可分為同形性自交不親和（homomorphic SI）和異形性自交不親和（heteromophic SI）［22］；根據花粉自交不親和性的遺傳控制方式，同形性自交不親和性又可分為孢子體型自交不親和（sporophytic SI,SSI）和配子體自交不親和（gametophytic SI,GSI）2種類型。配子體型自交不親和性即花粉在柱頭上萌發后可侵入柱頭，并能在花柱組織中延伸一段，此后受到抑制。孢子體型自交不親和性即花粉落在柱頭上不能正常萌發，或萌發后纏繞在柱頭乳突細胞上但卻無法侵入柱頭，花粉的這種行為取決于二倍體親本的基因型［11，23］。本研究在對鐵皮石斛進行自交和雜交時，發現花粉管中均含有精核，花粉管具有活力能正常生長進入花柱；授粉后1 h內，與自交相比，雜交花粉管生長速度略快；自交后花粉管在進入子房1/3處停止生長，而雜交花粉管順利進入子房；48～72 h時，自交花粉管逐漸消失，雜交后的花粉管不消失。由此可以判斷，鐵皮石斛屬于配子體自交不親和性，與蘭科植物甲蟲蘭屬Restrepia［23］，石斛屬的束花石斛Dendrobium chrysanthum［18］的自交不親和性相一致。這一結果可為鐵皮石斛克服自交不親和性以及組合雜交育種、創制新種質及種質資源保育提供理論基礎。

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