巨桉糖基轉移酶基因EgrGATL1序列特征及表達分析

陸 軍，孫麗娟，王曉榮，吉泓睿，倪曉詳，程龍軍

（1.浙江農(nóng)林大學 省部共建亞熱帶森林培育國家重點實驗室，浙江 杭州 311300；2.山東莒南縣望海樓國有林場 山東 莒南 276600）

糖基轉移酶（glycosyltransfereases,GTs）能把不同活化糖基轉移到糖鏈、核酸、蛋白質、脂質以及各種有機復合物等特異受體分子上，形成多糖分子和糖基化衍生物［1－2］，在生物代謝中作用巨大。糖基轉移酶廣泛參與植物代謝反應。首先，細胞的各種重要代謝產(chǎn)物如糖蛋白、糖脂、核酸、淀粉和蔗糖等的糖基都必須在糖基轉移酶作用下添加上去［4－5］；其次，組成細胞壁的纖維素、半纖維素和果膠等細胞組分的形成都需要糖基轉移酶參與［2］；另外，它還可以通過調節(jié)各種植物生長調節(jié)劑的糖基化，改變生長調節(jié)劑活性，參與植物生長發(fā)育以及對逆境因子的響應過程［6－7］。植物中糖基轉移酶及其相應基因功能研究對了解植物代謝效應，以及植物細胞對胞內、胞外環(huán)境的響應都有重要意義。編碼該類酶的基因在基因組中成員眾多，如擬南芥Arabidopsis thanliana中有450多個，水稻Oryza sativa中有600多個，楊樹Populus trichocarpa中有800多個［1，3］。該類基因通常以基因家族形式存在，目前已知的糖基轉移酶家族超過90個，其中植物中有40多個［3］。植物中GT8糖基轉移酶基因家族組成復雜，該基因家族成員數(shù)量眾多，僅擬南芥中就有41個屬于GT8家族的基因［1］。根據(jù)編碼蛋白序列特征和功能，可將GT8基因家族分成2大類。一類為半乳糖醛酸轉移酶（gAlac uronosyl transferase,GAUT），包括GAUT和GATL（GAUT-Like）2個子類。目前研究認為：該類基因主要參與果膠和木聚糖的生物合成，如擬南芥中GAUT1編碼的蛋白為半乳糖醛酸聚糖糖基轉移酶，參與果膠合成［8］。AtGAUT12的突變能大幅度降低植株中木聚糖含量［9］，GUX1，GUX2和GUX5也都參與植物木聚糖合成［10］，而果膠和木聚糖是細胞壁合成所必需的，表明GT8家族的基因在植物細胞壁合成中發(fā)揮重要作用［11－12］。另一類包括植物類糖原淀粉合成起始蛋白（plant glycogenin-lilke starch intiation proteins,PGSIPs）和乳糖苷合成酶（galactinol synthses,GolSs）。其中PGSIPs參與淀粉生物合成的啟動［13］；GolSs則是棉子糖類多糖合成的關鍵酶，后者能夠作為滲透調節(jié)劑在植物逆境響應中發(fā)揮重要作用［14－15］。糖基轉移酶家族成員眾多，糖基轉移酶功能特異性很強，即使添加同一個活化糖基，也可能因為受體不同而需要不同糖基轉移酶來完成［5］；而且，不同家族成員在功能上也存在交叉現(xiàn)象［16］。這些問題給糖基轉移酶基因功能研究帶來了很大困難。植物中糖基轉移酶相關基因功能研究仍處在起步階段，林木中此類基因的具體功能更是知之甚少。桉樹Eucalyptus是世界上三大用材樹種之一，其生產(chǎn)和地域分布極易受到低溫、干旱、高溫和高鹽等非生物逆境因子的影響。EgrGATL1（Eucgr.I01882）是巨桉Eucalyptus grandisGT8家族中一個基因成員，前期研究中發(fā)現(xiàn)該基因表達受低溫脅迫誘導，表明該基因可能與巨桉逆境響應有一定關系。目前一般認為植物GATL子類中的基因也主要與果膠和木聚糖生物合成有關［9,17-18］，但在水稻中也發(fā)現(xiàn)多個OsGATL基因受低溫、干旱和ABA處理的誘導，暗示植物中GATL基因可能在非生物逆境脅迫響應中發(fā)揮了一定功能［19］。本研究從EgrGATL的序列特征和低溫、干旱和高鹽脅迫以及脫落酸（ABA），茉莉酸甲酯（MeJA）處理下基因表達角度上，分析了EgrGATL1與巨桉抗逆的關系，為其進一步功能的研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所用材料為巨桉G5無性系，來源于中國林業(yè)科學研究院熱帶林業(yè)研究所曾炳山研究員實驗室。無性系幼苗種植于浙江農(nóng)林大學苗圃地。選取苗齡3個月，長勢一致的巨桉無性系幼苗作為實驗材料。在植物生長箱（Snijders MC1000，荷蘭）中正常培養(yǎng)，日溫為25℃，夜溫為22℃；光照/黑暗為14 h/10 h； 光強為 150 μmol·m－2·s－1， 相對濕度為 70%。

1.2 EgrGATL1基因、蛋白序列及啟動子元件分析

根據(jù)基因注釋編號Eucgr.I01882，從https：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#!info?alias=Org_E-grandis下載該基因核酸序列和蛋白序列。設計全長引物（表1）進行聚合酶鏈式反應（PCR）擴增，測序驗證。其編碼蛋白氨基酸序列用Protparam（http：//www.expasy.ch/tools）軟件進行分子量、等電點分析。結構域搜尋用保守域數(shù)據(jù)庫（CDD.https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd）結合EgrGATL1不同植物中同源蛋白多序列比對（Clustalx）以及 GT8 基因家族相關基因分析文獻進行［1，20］。

表1 實時熒光定量所用引物序列Table 1 List of primer sequences used in RT-PCR

EgrGATL1進化分類按照ULVSKOV對GATL基因的分類標準［21］，分別選取不同子組中相應擬南芥GATL蛋白序列，與EgrGATL1一起，用MEGA軟件構建1 000個自舉重復無根鄰接進化樹，對其作進化分類。

1.3 4℃不同處理時間下EgrGATL1共表達基因的代謝途徑分析

3個月苗齡巨桉幼苗于4℃低溫生長箱中，為避免由于取樣時間點不同對基因表達造成影響，實驗采用先后間隔0，24，36，42，46 h依次放入生長箱處理，以25℃生長條件下幼苗作為對照（ck）。處理完畢后一起收獲葉片（摘取枝條頂芽下面第3～5片完全展開的葉片），迅速投入液氮中，提取RNA進行數(shù)字表達譜（DGE）測序（諾禾致源）。結果中差異表達基因（＞2倍）用加權基因共表達網(wǎng)絡分析（WGCNA）計算與EgrNAC1具有共表達關系基因的Pearson系數(shù)（rco），根據(jù)rco大小進行基因排序。選取rco或rco絕對值＞0.9的基因，將這些基因的編碼蛋白序列在UniProtKB蛋白數(shù)據(jù)庫中進行Blastp（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）比對，在域值E值＜e-5范圍內篩選匹配度最好的一項提取蛋白序列編碼。然后將所有注釋蛋白的序列編碼提交到可視化整合蛋白注釋數(shù)據(jù)庫（DAVID）中，對比京都基因與基因組百科全書（KEGG）進行分析（https：//david.ncifcrf.gov/tools.jsp），對能夠在KEGG中找到相應代謝途徑的共表達基因進行統(tǒng)計、分析。

1.4 低溫、鹽、干旱、脫落酸（ABA）和茉莉酸甲酯（MeJA）處理下EgrGATL1表達分析

參考魏曉玲等［22］的方法，在生長箱中以25℃生長條件下幼苗作為對照（ck），-8，-4，0，4，8和42℃分別處理2 h；4℃不同時間處理實驗同1.3。處理后植株葉片迅速放入液氮，用于RNA提取。高鹽處理則將植株置于不同塑料容器（60 L）內，處理組塑料容器內保持植株栽培盆1/3高度的200 mmol·L-1氯化鈉溶液，對照組則用清水保持同樣液面高度。同樣采用間隔0，24，48，60，66 h的方法依次放入處理苗；干旱處理用5，3，2，1 d不澆水植株作為處理組，正常澆水的作為對照。100 μmol·L-1ABA和100 μmol·L-1MeJA處理采用植株葉面噴施的方法，ABA以噴施激素溶液后6，12，24，48 h植株作為處理組；MeJA以噴施激素溶液后2，12，24 h植株作為處理組，未噴施植株作為對照組（ck）。實驗結束后，統(tǒng)一收獲葉片，提取RNA。實驗設9株·處理-1，3株·重復-1，共3個重復。

1.5 RNA提取、cDNA合成及基因定量表達分析

根據(jù)王亞紅等［23］的方法提取樣品RNA。組織特異性表達分析以正常生長條件下苗齡3個月的巨桉根、木質部、韌皮部和葉為RNA提取材料。RNA反轉錄利用PrimeScriptRRT reagent Kit（TaKaRa，大連，中國）試劑盒完成。定量熒光染料SYBR-Green（Takara，大連，中國）和BIO-RAD CFX96實時PCR系統(tǒng)（Bio-Rad，美國）用于EgrGATL1基因的定量RT-PCR。以Egr18SrRNA作為內參基因，實驗設3個重復。結果用Bio-Rad CFX Manager（Version 1.5.5.34）軟件進行分析。并用GraphPad（ver 4.0）進行作圖。引物序列見表1。

2 結果與分析

2.1 EgrGATL1基因和蛋白序列結構分析

EgrGATL1基因全長cDNA為1 319 bp，開放閱讀框長1 062 bp，沒有內含子，編碼一個353個氨基酸殘基組成的蛋白。Protparam軟件預測其分子量為39.5 kD，等電點為6.83。將其編碼蛋白質序列與其他物種中同源蛋白質進行多序列比對。結果表明：其與橙Citrus sinensis（CsGATL），擬南芥（At-GATL10）， 梅Prunus mume（PmGATL）和煙草Nicotiana tomentosiformis（NtGATL）等的半乳糖醛酸轉移酶類似蛋白（GATL）氨基酸序列相似程度很高，蛋白質序列中含DxD和HxxGxxKPW 2個GT8家族的典型特征基序（motif），表明該類蛋白質屬于糖基轉移酶GT8家族的蛋白質；同時，蛋白質序列中還有A（RxYLxxIL），B（CxFN）， C（LPPF）和 D（WxxxGL）基序，它們則是 GT8家族中 GATL子類成員編碼蛋白質序列的重要特征［20］。這些結果說明EgrGATL1是半乳糖醛酸轉移酶類似基因（圖1）。

圖1 EgrGATL1蛋白與其他植物同源蛋白序列的比對Figure 1 Mutiple alignment of EgrGATL1 and its homologus proteins from other plants

根據(jù)YIN等［1］對GT8基因家族中GATL子類的分類，將擬南芥中不同類別的GATL基因編碼蛋白質序列與EgrGATL1一起進行進化樹構建，結果中可以看出EgrGATL1屬于GATL-a子組，與擬南芥中的AtGATL10（At3G28340）基因編碼蛋白質親緣關系最近（圖2）。

圖2 EgrGATL1蛋白在不同GATL子類中的分類Figure 2 Classification of EgrGATL1 in GATL subgroups

2.2 4℃不同處理時間EgrGATL1共表達基因的KEGG分析

在4℃不同時間（0，2，6，12，24，48 h）處理下，EgrGATL1基因被強烈誘導，各處理時間下EgrGATL1的RPKM值分別為 0.77，75.29，82.44，113.23，74.67和 182.95。各處理時間點葉片中EgrGATL1的表達水平均為對照（0 h）的97倍以上。分析4℃不同處理時間下EgrGATL1共表達基因，選取其正向共表達基因90個（rco＞0.90），負向共表達基因106個（＞0.90），共196個基因進行KEGG分析。發(fā)現(xiàn)能與現(xiàn)有KEGG途徑相匹配的基因有25個，其中參與基礎代謝的基因18個，參與次生代謝物生物合成的基因13個（部分基因參與了1個以上的代謝途徑）。這些KEGG途徑包括各種糖相關代謝及合成途徑，如糖酵解代謝，果糖和甘露糖代謝，半乳糖代謝，磷酸戊糖途徑，氨基糖和核糖代謝，N-糖苷生物合成，淀粉和蔗糖代謝等；這些途徑中包含11個基因。氨基酸代謝和生物合成途徑如甘氨酸、絲氨酸和酸酸代謝，半胱氨酸和甲硫氨酸代謝，酪氨酸代謝，精氨酸和脯氨酸代謝，谷胱甘肽代謝以及氨基酸的生物合成等，包含8個基因。其他還包括嘌呤代謝，煙酸和煙酰胺代謝，卟啉與葉綠素代謝，碳固定與代謝以及脂肪酸代謝等（圖3）。盡管EgrGATL1高相關性共表達基因中，可用于KEGG分析的基因比例不高（12.8%），但仍能在一定程度上說明這些基因可能在代謝層面上主要參與糖代謝和氨基酸代謝，暗示這些代謝途徑與EgrGATL1作用發(fā)揮具有一定協(xié)同性。

圖3 4℃不同處理時間下EgrGATL1共表達基因的KEGG分析Figure 3 KEGG analysis for co-expression genes of EgrGATL1 under time course treatment at 4℃

2.3 EgrGATL1的組織表達分析

EgrGATL1在不同組織、器官中的表達有一定差異，木質部和韌皮部中表達水平較高，葉片中次之，根中表達量較低（圖4）。作為GATL家族成員，可能在細胞壁生物合成過程中會發(fā)揮一定作用。

2.4 低溫、高鹽、干旱以及脫落酸和茉莉酸甲酯處理下EgrGATL1基因表達分析

定量RT-PCR結果表明：在4℃不同時間處理下，處理2 h后EgrGATL1表達即出現(xiàn)上調，為對照（25℃）的6.8倍，處理12 h后表達量達最大，是對照的42.8倍；隨著時間延長，表達量有所下降，但仍處于被誘導狀態(tài)（圖5A）。不同低溫（－8，－4，0，4，8℃）下EgrGATL1表達都被誘導，但零上水平低溫對基因誘導作用更強，在8℃時誘導表達量最高，相對表達量是對照的143倍；高溫脅迫（42℃）對EgrGATL1表達并沒有明顯改變（圖5B）。

圖4 巨桉EgrGATL1基因在根、木質部、韌皮部和葉片中表達Figure 4 Analysis of EgrGATL1 expression in root,xylem,phloem and leaf

圖5 4℃不同時間（A）和不同溫度（B）處理下巨桉中EgrGATL1基因的相對表達差異Figure 5 Relative expression of EgrGATL1 under time course treatment at 4℃ （A）and different temperatures（B）

在200 mmol·L－1氯化鈉處理下，EgrGATL1受高鹽抑制，巨桉葉片中基因表達隨處理時間延長不斷下降，處理48 h后，基因表達水平下降為對照處理的0.02倍（圖6A）。干旱處理前2 d基因表達被誘導，隨后表達水平出現(xiàn)了一定波動，先是下降，而后又有所上升（圖6B）。在100 μmol·L－1脫落酸處理下，EgrGATL1表達同樣隨時間延長受到明顯抑制。有意思的是，脫落酸處理與鹽脅迫處理，基因受抑制的規(guī)律幾乎完全同步（圖6A，圖6C）。EgrGATL1表達對茉莉酸甲酯也有響應，茉莉酸甲酯處理2 h，即可強烈誘導基因表達，使EgrGATL1表達水平達到對照的211.3倍，之后誘導作用減弱，24 h后表達水平僅為對照的2.1倍，顯示茉莉酸甲酯對EgrGATL1產(chǎn)生的是瞬時誘導作用（圖6D）。

圖6 高鹽、干旱、脫落酸和茉莉酸甲酯處理下巨桉中EgrGATL1基因的相對表達差異Figure 6 Relative expression of EgrGATL1 under salinity,drought,ABA and MeJA treatments in Eucalyptus grandis

3 討論

從蛋白質序列分析可以知道EgrGATL1是一個典型半乳糖醛酸轉移酶（GATL）類似基因，在子類分類中屬于GATL-a子組［20］。一般認為GATL子類成員可能參與細胞壁中果膠或者木聚糖生物合成［24］。如AtGATL1，AtGATL13 和AtGATL16 參與細胞次生壁形成中木聚糖生物合成［9－10，17］；AtGATL9 參與果膠生物合成［10］。這些基因的功能改變都會在一定程度上影響細胞壁的結構。也有GATL成員參與種皮黏液形成，AtGATL5被認為調控構成種皮黏液主要成分黏性鼠李半乳糖醛酸聚糖鏈的大小［25］。EgrGATL1在木質部和韌皮部中相對根和葉片的高表達現(xiàn)象，也在一定程度上說明它也有可能參與植物細胞壁組分的生物合成。

不同低溫（－8， －4， 0， 4， 8 ℃）， 低溫（4 ℃）不同處理時間（0， 2， 6， 12， 24， 48 h）以及干旱都能誘導EgrGATL1表達，說明該基因在植物非生物逆境響應中可能也發(fā)揮一定作用。水稻中7個GATL基因中有6個受干旱誘導，5個受低溫誘導［19］，表明GATL基因參與非生物逆境脅迫響應不是孤立的現(xiàn)象。植物受到冷脅迫時，細胞中混合多糖含量大幅度提高，半乳糖醛酸和糖醛酸含量增加［26］；細胞壁成分中果膠和非纖維素成分往往發(fā)生積累，其中果膠含量的提高能增強植物細胞抗壓強度和細胞壁厚度，降低細胞遭受低溫危害的程度［27－28］。干旱條件下，植物也可能通過果膠修飾，產(chǎn)生細胞壁重構作用，提高抗旱能力［26］。抗干旱的小麥品種Triticum aestivum‘Capeiti’在干旱條件下，細胞中果膠鼠李半乳糖醛酸聚糖Ⅰ（RGⅠ）和Ⅱ（RGⅡ）側鏈含量大幅度增加，而干旱敏感型品種卻沒有類似情況發(fā)生。果膠中RGⅠ和RGⅡ側鏈的增加能夠提高其水合能力，增加植物的保水性能，進而提高其抗寒性［29］。因此，低溫、干旱條件下巨桉EgrGATL1的誘導表達極有可能是因為該基因通過參與細胞壁組分生物合成，進行細胞壁重構來影響植物非生物逆境抗性的。細胞壁重構在植物非生物逆境響應中發(fā)揮作用的研究是目前植物抗逆研究的一個熱點［26］。在細胞壁重構過程中，涉及大量糖代謝途徑［30－31］，低溫（4℃）不同時間處理下EgrGATL1共表達基因KEGG途徑分析中，各種糖代謝途徑的相關共表達基因可能與EgrGATL1基因功能發(fā)揮有一定協(xié)同作用。這為EgrGATL1進一步功能研究提供了線索。

糖基轉移酶還可能對植物生長調節(jié)劑的作用產(chǎn)生影響，進而改變植物的生長、發(fā)育及逆境響應過程。生長素（IAA），脫落酸，細胞分裂素（CK），油菜素內酯（BRs）和水楊酸（SA）等都可以被糖基轉移酶糖基化而改變激素活性［32］。細胞分裂素以核糖化的形式在木質部運輸［33］；而擬南芥中糖基轉移酶UGT71B6則可以通過形成脫落酸糖酯的形式使脫落酸失活，進而調控干旱、高鹽等逆境下植物的響應［34］。本研究中脫落酸和鹽脅迫對EgrGATL1基因表達都有抑制作用，而且隨處理時間變化，基因受抑制的規(guī)律幾乎完全同步。這暗示EgrGATL1有可能參與巨桉鹽脅迫下脫落酸的調控，對這一推測的證實及其相應具體調控機制的研究，將是下一步開展的重點內容。茉莉酸甲酯處理下EgrGATL1的表達也存在瞬時誘導作用，盡管茉莉酸甲酯的信號轉導作用參與了植物干旱和高鹽脅迫逆境響應過程［35］，但它與糖基轉移酶之間的關系目前仍不清楚，同樣需要進一步研究加以揭示。

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