核桃抗逆基因JrGSTU23的克隆及表達分析

高向倩，李憶林，賈彩霞，李大培，楊玉婷，楊桂燕

（1.西北農林科技大學 林學院 山陽核桃板栗試驗示范站，陜西 楊凌 712100；2.西北農林科技大學 林學院 陜西省經濟植物資源開發利用重點實驗室，陜西 楊凌712100）

谷胱甘肽轉移酶（GSTs）是一個多功能的二聚體酶超家族，具有解毒、清除細胞內活性氧等功能［1］。在植物中，GSTs根據其功能和序列等特征被分為8個亞家族：alpha，mu，pi，sigma，theta，kappa，zeta 和線粒體（microsomal）GSTs［1－3］。 目前， 很多植物中的GST基因被陸續克隆［4-5］， 并進行功能研究， 發現來自不同植物的GST同源基因或相同植株的不同GST基因，其功能具有一定差異。大多數GSTs基因具有響應逆境脅迫的功能。如前期研究發現，檉柳Tamarix hispida的zeta家族基因ThGSTZ1能被氯化鈉，聚乙二醇（PEG 6000），脫落酸（ABA）和甲基紫精（MV）等脅迫調控，過量表達情況下能提高轉基因株系抵抗鹽、旱、MV及ABA等脅迫的能力［6－7］。核桃Juglans regia的JrGSTTau1基因也能響應不同逆境刺激，過量表達能改善植株應對低溫脅迫的能力［8］。在羽衣甘藍Brassica oleracea中分離獲得65個GST基因，其中BoGSTU19，BoGSTU24，BoGSTF10能被冷脅迫強誘導，推測它們與冷脅迫響應具有重要關系［9］。水稻Oryza sativa OsGSTl2轉基因擬南芥Arabidopsis thaliana表現出較高的重金屬耐受力［10］。這些研究表明：GST基因在植物響應逆境應答及調節中具有多方面的作用，因此具有重要的研究價值。GST家族成員眾多，目前對GST基因的研究主要集中在草本植物，對木本植物GST基因的研究較少，特別是經濟干果核桃鮮見報道。核桃屬多年生落葉喬木，是中國主要經濟樹種之一。近年來全球環境的變化，環境因子特別是西北地區越冬入春出現的 “倒春寒”及夏秋核桃成熟期嚴重的高溫干旱等氣候現象，嚴重制約了核桃產業的發展。因此，篩選核桃逆境響應重要基因，研究其逆境響應功能機制，將對了解核桃的逆境適應機制具有指導作用。本研究從核桃中鑒定獲得1條GST基因JrGSTU23，通過生物信息及定量表達分析其生物學功能，以期為核桃抗逆響應研究提供候選基因。

1 材料與方法

1.1 材料及處理

選取培養于相同條件下的2年生 ‘香玲’ ‘Xiangling’核桃嫁接苗用作研究材料。處理包括非生物脅迫［100 g·kg-1聚乙二醇（PEG 6000）， 0.3 mol·L－1氯化鈉、 低溫 6 ℃］和激素處理［0.1 mmol·L－1脫落酸（ABA）］， 100.0 mg·L－1茉莉酸（MeJA）及 2.0 mg·L－1水楊酸（SA）。 分別在 0， 3， 6， 12， 24， 48 h 取樣，以0 h正常澆水作為對照，重復3次·處理－1。分別收集各處理后的根和葉，用液氮速凍后保存于-80℃冰箱備用。

1.2 JrGSTU23基因的克隆與分析

以 “glutathione transferase”為關鍵詞在 ‘香玲’核桃轉錄組數據中查找GST基因，經BLAST比對選取其中1條GST基因（命名為JrGSTU23）進行分析。用ORF finder（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）確定JrGSTU23基因開放讀碼框（ORF），再根據ORF兩端序列設計引物JrGSTU23-F和JrGSTU23-R（表1），進行聚合酶鏈式反應（PCR）擴增。產物經回收純化后與pMD-18-T載體連接并轉化大腸埃希菌Escherichia coliDH5ɑ感受態細胞。挑取陽性克隆擴大培養進行菌液PCR驗證，對獲得目的片段的克隆測序。利用Expasy ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）對確認的JrGSTU23基因序列特征進行分析。利用BLASTP（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast）進行序列同源性搜索；利用Clustal 3.0軟件對不同物種的GST蛋白進行多序列比對和進化分析。使用PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）分析該基因啟動子中含有的順式作用元件。利用Expasy中Swiss Model程序同源建模，推測該蛋白的三維結構模型。

表1 研究所用引物Table 1 The used primers

1.3 JrGSTU23的表達分析

各樣品總核糖核酸（RNA）采用十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）方法提取［8］，RNA經DNA消化酶處理后采用PrimeScriptTMRT Reagent Kit（CWBIO，康為世紀，中國）反轉錄為cDNA，稀釋10倍后用作實時熒光定量PCR（qRT-PCR）的模板。qRT-PCR參照SYBR Green Real time PCR Master mix（CWBIO）進行，內參基因為核桃 18S rRNA（HE574850）基因［10］。JrGSTU23定量引物為 DL-F和 DL-R（表1）。 定量反應儀器為Applied Biosystems生產的Step OneTMReal-Time PCR System。反應程序為：94℃預變性30 s；94℃變性12 s，60℃退火45 s，72℃延伸 45 s，45個循環；81℃讀板 1 s， 重復3次·樣品－1。 采用 2-ΔΔCt法對定量結果進行相對分析［11］，所有表達值均做了以2為底的對數轉化。

2 結果與分析

2.1 JrGSTU23全長cDNA序列分析

通過查找核桃轉錄組數據獲得1條GST基因，根據獲得的cDNA序列設計引物JrGSTU23-F/R進行PCR驗證，經分析發現該基因ORF長684 bp，擬推導的蛋白分子量為25.89 kDa，含有氨基酸數為227，理論等電點為5.20。BLAST分析發現：該基因與核桃轉錄組中的GST23基因相同。保守結構域分析發現：該蛋白具有GST-Tau保守域（圖1），表明該蛋白屬于GST氧硫還蛋白亞家族（thioredoxin-line superfamily，Thi），因此命名為JrGSTU23（GeneBank登錄號：MG356784）。經美國生物技術信息中心（NCBI）同源搜索獲得相似蛋白，并進行進化分析，發現JrGSTU23蛋白與香蕉Musa accuminata，毛果楊Populus trichocarpa等的進化關系較近（圖2）。通過Swiss Model程序同源建模，推測該蛋白的三維結構如圖3所示。

2.2 JrGSTU23啟動子分析

以JrGSTU23在NCBI數據庫中進行同源搜索，發現其與 ‘強特勒’核桃的GST序列（XM_018974105.1）一致。因此，分析XM_018974105.1序列起始密碼子上游2 000 bp的DNA序列作為基因啟動子，并對其順式作用元件進行分析，為預測JrGSTU23基因的功能及可能調控機制提供參考依據。PlantCARE預測結果顯示，JrGSTU23啟動子包含多個與逆境響應及激素調控相關的順式作用元件，如熱脅迫響應元件（HSE），干旱響應元件（MBS），茉莉酸響應元件（CGTCA-motif），水楊酸響應元件（TCA-element）等（表 2）。

2.3 外源激素脅迫對JrGSTU23表達的影響

對試材分別進行ABA，MeJA，SA等激素處理。qRT-PCR實驗發現：JrGSTU23能被這些激素明顯誘導，但在根和葉的表達趨勢不同（圖4）。在葉中，ABA處理3～6 h被抑制，24 h達最大表達水平（2.85）；MeJA脅迫下與ABA相反，隨著脅迫時間延長，JrGSTU23的表達水平逐漸下降，在24 h被抑制（－0.98）；SA脅迫3～6 h也被抑制，在24 h達最大值4.13，但其最低值出現在3 h，為－0.01。在根中，JrGSTU23在ABA脅迫下的最大和最小轉錄水平分別出現在12和24 h，分別為4.35和2.74；MeJA處理下，該基因的最大和最小表達量分別為7.24（12 h）和2.73（3 h）；而在SA脅迫下，JrGSTU23的表達隨脅迫時間延長而增強，最大值為4.57倍（24 h）。表明JrGSTU23基因能不同程度響應ABA，Me-JA，SA的脅迫，并表現出組織特異性，但其具體的響應機制可能不同。

2.4 不同非生物脅迫對JrGSTU23基因表達的影響

qRT-PCR結果顯示：JrGSTU23能被氯化鈉，聚乙二醇（PEG 6000），6℃等不同脅迫明顯誘導，且在大多數時間點下的表達差異顯著（圖4）。氯化鈉脅迫下，JrGSTU23在根和葉中的表達趨勢相似，均隨著脅迫時間的延長表達增高，在脅迫24 h達最大表達水平，分別為2.49和4.11。但除3 h外，其他處理點該基因在根中的表達水平高于在葉中的表達。PEG 6000模擬干旱脅迫3～12 h，JrGSTU23在葉中的表達被抑制，24 h被誘導為1.76；在根中的表達趨勢與氯化鈉脅迫相似，隨著脅迫時間延長而增大，且在24 h達最高水平，但表達量低于氯化鈉脅迫。表明JrGSTU23應對氯化鈉和干旱脅迫的響應機制可能相似，但JrGSTU23對鹽脅迫可能更為敏感。低溫脅迫下，JrGSTU23在葉中的表達在6 h（1.22）和24 h（2.30）出現2個高峰；在根中，其表達趨勢與氯化鈉和干旱脅迫相似，隨著脅迫時間延長而升高，在24 h 達最大值（3.06）。

圖1 JrGSTU23蛋白與其同源蛋白序列的氨基酸聚類分析Figure 1 Amino acid sequence alignment between JrGSTU23 and its homologous proteins from other species

圖2 JrGSTU23蛋白與其他物種相似蛋白氨基酸序列的系統進化樹分析Figure 2 Phylogenetic tree of JrGSTU23 protein and its homologs from other species

圖3 JrGSTU23蛋白三維結構預測模型Figure 3 Predicted 3D structure model of protein JrGSTU23

表2 PlantCARE預測JrGSTU23啟動子區順式作用元件Table 2 Cis-acting regulatory elements in JrGSTU23 promoter predicted by PlantCARE

圖4 JrGSTU23基因在不同脅迫處理下的表達水平Figure 4 Expression level of JrGSTU23 gene under different stresses

3 討論

GSTs是植物響應逆境的重要基因，在植物解毒等方面具有重要作用。其中，含有Tau保守結構域的GST亞家族基因，參與植物眾多的逆境響應。核桃作為中國西北地區扶貧攻堅項目的重要經濟樹種，在推動區域經濟發展上具有重要作用。核桃產業的健康快速發展與核桃產量和質量息息相關。但氣候等環境因子嚴重制約了中國核桃產業的發展，因此，選育抗逆優良核桃品種，掌握核桃抗逆適應機制，對深入了解核桃的適應性具有重要指導作用。本研究從 ‘香玲’核桃中克隆獲得1條Tau家族的GST基因（JrGSTU23），經進化分析發現該基因與來自水稻、香蕉、毛果楊、大豆Glycine max等物種的Tau家族基因具有較近的親緣關系，推測其可能與這些蛋白具有相似或相近的功能。如，水稻Osgstu4和Osgstu3能迅速被抗氧化劑和過氧化氫誘導，表明Osgstu4和Osgstu3的應答反應涉及氧化還原反應［12］。大豆GmGSTU2-2是嚴格的滲透脅迫型響應基因，參與植物脅迫反應中的催化和調節功能網絡［13］。毛果楊的GSTU16和GSTU45能被三硝基甲苯（2,4,6-trinitrotoluene）誘導［14］。因此，推測JrGSTU23與逆境應答具有重要關系。

順式作用元件一般由5～20個堿基對組成，是同一DNA分子中具有轉錄調節功能的特異DNA序列［15］。海蓬子Salicornia brachiata的一個Tau類GST基因的上游1 023 bp啟動子包含有非生物脅迫響應相關的ABA響應元件（ABRE），干旱響應基因rd22識別位點（MYB），結節特意表達元件（NOD），光響應表達元件（GATA），光調控表達元件（GT1）及激素、病害和損傷等相關的順式作用元件，參與了該基因響應氯化鈉和滲透脅迫的表達調控［16］。玉米Zea mays的ZmCIPK10和ZmZIP71基因啟動子序列中含有ABA，SA，赤霉素（GA），低溫等相關的順式作用元件，在氯化鈉、干旱、低溫脅迫下，ZmCIPK10和ZmZIP71的表達量上升，表明其參與了玉米的逆境響應［17－18］。本研究發現：JrGSTU23基因啟動子含有豐富的順式作用元件，如玉米素代謝、種子調控、分生組織激活、胚乳表達以及干旱脅迫、熱脅迫、防衛、MeJA和SA等響應相關的元件（表2）。由此可推測，JrGSTU23可能參與植物生長發育及逆境響應過程，具有深入研究的價值。

GSTs基因響應逆境具有組織表達特異性。本研究發現的JrGSTU23基因在不同激素（SA，MeJA，ABA）及不同逆境（氯化鈉、干旱、低溫）下在根和葉中能被不同程度地誘導表達，體現了一定的組織表達特異性和逆境響應特異性。這與其他物種的Tau家族GST基因的逆境響應表達具有一定的相似性。如從香蕉克隆獲得的5個GST基因（MaGSTU1，MaGSTU2，MaGSTU3，MaGSTF1，MaGSTL1）的表達具有組織特異性，在鹽、干旱、冷等脅迫下Tau亞家族的MaGSTU1，MaGSTU2，MaGSTU3的表達受鹽、干旱、冷誘導更為明顯，而MaGSTF1和MaGSTL1更受信號分子影響［19］，預測這些GST基因對不同逆境的響應功能具有差異。鹽脅迫下，番茄Solanum lycopersicum的SlGSTU23和SlGSTU26基因在葉中被上調表達［20］，推測這些GST基因在不同逆境下的具體功能可能不同。JrGSTTau1在低溫脅迫下也表現出根、葉表達差異，過表達提高了植株的抗寒能力［8］。可見，通過分析基因響應不同逆境的轉錄水平，可以推測其在逆境響應中可能的生物學功能。JrGSTU23能不同程度地響應激素及非生物脅迫，表明其參與了核桃的逆境響應調控。后續研究將通過在植株中過量表達全面分析JrGSTU23基因的抗逆響應功能。

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