香港四照花外植體的抗褐化處理與誘導培養

陳夢倩，范李節，王小德

（浙江農林大學 風景園林與建筑學院，浙江 杭州311300）

香港四照花Dendrobenthamia hongkongensis是山茱萸科Cornaceae四照花屬Dendrobenthamia常綠喬木，自然分布于華東、華南、西南等地區。主干通直，冠型飽滿；初夏頭狀花序頂生，花苞片大而潔白，觀賞性強；秋季核果聚生成球形，紅艷可愛，既可食用又可釀酒、入藥［1-2］。四照花屬的大部分植物種子都具有深休眠的特性，影響了優良種質資源的有性繁殖和推廣［3］。植物組織培養技術作為一種成熟的擴繁技術，不僅能保持繁殖體的優良特性，且繁殖速度快，周期短，不受場地、環境限制，是苗木良種化、工廠化的重要途徑［4］。因此，進行香港四照花的誘導培養研究，對香港四照花的擴繁和推廣應用具有現實意義。香港四照花在初代培養中極易褐化，會影響外植體的誘導與生長，嚴重時能致其死亡，故對它進行抗褐化研究顯得尤為重要。目前，常用的抗褐化措施有預處理材料，選擇適宜的培養條件，使用抗褐化劑等［5］。其中，常用抗褐化劑主要有聚乙烯吡咯烷酮（PVP），活性炭（AC），抗壞血酸（VC）， 硫代硫酸鈉（Na2S2O3）及檸檬酸（CA）等［6］。 劉均利等［7］發現 PVP 對華蓋木 Manglietiastrum sinicum外植體的抗褐化效果顯著。李萍等［8］研究表明，在培養基中加入2.0 g·L－1AC培養4 d再轉入不含AC的培養基中，能有效控制牡丹Paeonia suffruticosa外植體褐化。本研究選擇香港四照花嫩葉、莖段和帶芽莖段為外植體，通過不同消毒方式處理、篩選基本培養基、材料預處理和使用抗褐化劑等方法，以期得出能有效降低香港四照花外植體褐化率的最佳方案，并采用正交試驗法，研究不同植物生長調節劑種類及質量濃度對外植體誘導的影響。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗所用材料為浙江農林大學校園的香港四照花，于2017年3月中旬至5月中旬，選擇生長健壯、無病蟲害的當年生嫩葉、莖段和帶芽莖段作為外植體。

1.2 試驗方法

1.2.1 培養基與培養條件 所有基本培養基若無特殊說明均為木本植物用培養基（woody plant medium，WPM）， 添加蔗糖 30.0 g·L－1， 瓊脂 6.0 g·L－1， 除植物生長調節劑配比試驗外， 均附加 1.0 mg·L－16 芐基腺嘌呤（6-BA）+0.2 mg·L－1萘乙酸（NAA）， pH 5.8。 各試驗中 3 種外植體均接種 20 瓶·處理-1， 3 個·瓶－1，重復 3 次·處理－1。培養室溫度為（25±2）℃，光照時間 12 h·d－1， 光照強度 1 800～2 000 lx， 接種后先暗培養7 d再進行光培養。

1.2.2 外植體的消毒處理 將采集的3種外植體用流水沖洗并用軟毛筆刷去表面臟物，放在洗潔精溶液中浸泡5 min，流水沖洗1 h。瀝干水后，在超凈工作臺上先用體積分數為70%乙醇消毒30 s，用無菌水漂洗 3 次后，分別用 2 種消毒劑處理： 30.0 mL·L－1次氯酸鈉（NaClO）溶液（5， 10，15 min）和 1.0 g·L－1氯化汞（HgCl2）溶液（5，8，10 min），消毒后用無菌水漂洗5遍。切除與消毒液接觸的傷口部位，將嫩葉切成1.0 cm×1.0 cm大小，莖段和帶芽莖段切成1.0～1.5 cm長，接種于培養基上。每日觀察統計污染率和存活率。

1.2.3 基本培養基的篩選 采用1.2.2篩選出的最佳消毒方式處理的3種外植體，分別接種在MS（Murashige and Skoog），DKW（Driver and Kuniyuki），WPM培養基上。每日觀察統計褐化率及誘導率。

1.2.4 外植體抗褐化預處理 將流水沖洗1.0 h后的外植體分別置于1.0 g·L－1PVP，1.0 g·L－1檸檬酸和1 g·L－1VC中浸泡3.0 h，以未預處理為對照（ck），浸泡后將3種外植體置于超凈工作臺上消毒并接種。每日觀察統計褐化率。

1.2.5 抗褐化劑實驗 在培養基中添加不同質量濃度的 PVP（0.5，1.0，2.0 g·L－1）， 檸檬酸（0.5，1.0，2.0 g·L－1）， VC（0.5， 1.0， 2.0 g·L－1）， 活性炭（0.5， 1.0， 2.0 g·L－1）和硫代硫酸鈉（0.1， 0.2， 0.5 g·L－1），以不添加任何抗褐化劑為對照（ck），將3種外植體接種到各培養基中。每日統計外植體褐化率。

1.2.6 植物生長調節劑配比試驗 采用正交試驗設計L9（34），在WPM培養基中添加不同質量濃度6-BA（0.5， 1.0， 2.0 mg·L－1）， NAA（0， 0.1， 0.2 mg·L－1）和 2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D， 0.1， 0.2， 0.5 mg·L－1），接種后每日觀察并記錄外植體啟動時間，統計出愈率及萌發率。

1.3 數據統計與處理

在接種后第30天統計各處理的數據。用Excel 2007進行數據處理，SPSS 19.0進行方差分析。污染率=（形成愈傷組織的外植體數/接種外植體數）×100%；褐化率=（外植體褐化數/接種外植體數）×100%；存活率=（存活的外植體數/接種外植體數）×100%；誘導率=（誘導數/接種外植體數）×100%；出愈率=（誘導出愈傷組織的外植體數/接種外植體數）×100%；萌發率=（誘導出芽的外植體數/接種外植體數）×100%。

2 結果與分析

2.1 消毒時間對外植體污染率及存活率的影響

3種外植體消毒處理結果表明（表1）：隨著消毒時間延長，3種外植體污染率都有顯著下降（P＜0.05）。結合30 d后統計的存活率（圖1B），1.0 g·L-1氯化汞溶液消毒5 min為最佳消毒時間，嫩葉污染率僅為33.89%，莖段、帶芽莖段分別為25.00%和27.78%，3種外植體之間差異顯著（P＜0.05）。用30.0 mL·L-1次氯酸鈉溶液消毒的外植體褐化情況較輕，但自培養第4天起不斷出現污染，污染率較高，且存活率較低（圖1A）。

表1 不同消毒藥劑及時間對3種外植體污染率的影響Table 1 Effects of different disinfectants and time on the contamination rate of 3 explants

圖1 不同消毒藥劑及時間處理下的3種外植體存活率Figure 1 Survival rate of 3 explants treated with different disinfectants and time

2.2 不同基本培養基對外植體褐化及誘導的影響

將3種外植體接種于MS，DKW和WPM等 3種不同基本培養基，結果表明（表2）：接種于WPM培養基的3種外植體褐化率均低于接種于MS和WPM培養基的褐化率，嫩葉、莖段和帶芽莖段的褐化率分別是67.8%，60.0%和61.7%。試驗中發現莖段與嫩葉經誘導產生愈傷組織，帶芽莖段經誘導易萌發出新芽，其中接種于WPM培養基的外植體生長狀況最好，誘導率最高。WPM與其他2種培養基的外植體褐化率與誘導率均差異顯著（P＜0.05），故以WPM培養基為最適基本培養基。

2.3 不同抗褐化劑預處理對外植體褐化率的影響

表 3 表明：采用 1.0 g·L－1PVP，1.0 g·L－1VC 和 1.0 g·L－1檸檬酸浸泡 3 h 的外植體褐化率都有所下降，其中1.0 g·L－1PVP預處理后的外植體褐化率最低，與對照（ck）差異顯著（P＜0.05）。3種外植體經1.0 g·L－1PVP預處理后，莖段褐化率為33.3%，顯著低于嫩葉褐化率（50.6%）和帶芽莖段褐化率（38.9%）（P＜0.05）。

表2 不同基本培養基對外植體褐化及誘導的影響Table 2 Effects of different basic culture medium on the browning rate and induction rate of explants

表3 不同抗褐化劑預處理對3種外植體褐化率的影響Table 3 Effects of pretreatment with different anti browning agents on the browning rate of 3 explants

2.4 不同抗褐化劑及質量濃度對外植體褐化率的影響

以未添加抗褐化劑為對照（ck），在培養基中添加不同質量濃度的PVP，檸檬酸和VC后，3種外植體褐化率均低于ck（表4），且與ck差異顯著（P＜0.05）。添加0.5 g·L－1活性炭后，外植體褐化情況顯著下降（P＜0.05），但若培養基活性炭質量濃度過高，反而加重外植體褐化。在培養基中添加了不同質量濃度的硫代硫酸鈉，3種外植體褐化率隨質量濃度上升而上升。由表4得知：2.0 g·L－1PVP為莖段和帶芽莖段的最佳抗褐化劑，其褐化率分別為13.3%和16.7%，與其他抗褐化劑有顯著的差異（P＜0.05）。嫩葉的最佳抗褐化劑為1.0 g·L－1檸檬酸，褐化率為27.4%。嫩葉褐化率與莖段、帶芽莖段褐化率差異性顯著（P＜0.05），莖段與帶芽莖段之間差異不顯著（P＞0.05）。

2.5 不同植物生長調節劑種類及質量濃度對外植體誘導的影響

由6-BA，NAA和2,4-D的極差（R）可知：嫩葉與莖段愈傷組織誘導的主因素分別為2,4-D（11.30）和NAA（20.52）（表 5）。 葉片誘導愈傷組織的最佳培養基組合為 WPM+1.0 mg·L－16-BA+0.2 mg·L－1NAA+0.1 mg·L－12,4-D，出愈率為58.3%，8 d葉片四周產生愈傷組織（圖2A）。莖段與葉片啟動時間相近，7 d基部膨大并長出少量愈傷組織（圖2B），其最佳愈傷組織誘導培養基為WPM+2.0 mg·L－16-BA+0.5 mg·L－12,4-D，出愈率為75.4%，與其他處理間存在顯著差異（P＜0.05）。

由不同因素的極差（R）可知（表6）：影響帶芽莖段誘導的主因素為6-BA。經Tukey s-b分析可知：7號和4號處理與其他處理有顯著差異（P＜0.05），其萌發率分別為76.7%和72.8%。故帶芽莖段誘導新芽的最佳組合為 WPM+2.0 mg·L－16-BA+0.5 mg·L－12,4-D， 萌發時間為 8 d（圖 2C）。

3 結論與討論

褐化現象制約著木本植物組織培養的發展，本試驗采用單因素試驗法，從不同消毒方式、基本培養基、外植體預處理方式、抗褐化劑等4個方面進行研究，尋找降低香港四照花褐化率的有效途徑。結果表明：外植體采用1.0 g·L-1氯化汞消毒5 min存活率最高。這與路承香等［9］的研究結果一致，與唐佳佳等［3］在狹葉四照花Dendrobenthamia angustata的研究結果不一致，可能因其選用1年生幼苗更易滅菌。3種外植體接種于WPM培養基中褐化率最低，誘導率相對較高，生長狀況最好。推測原因為WPM培養基無機鹽總含量較低，減輕了外植體褐變［10］。想從根本上解決組織培養中外植體褐化的問題，還需從分子、遺傳等角度對其外植體進行更深入的研究。

表4 不同抗褐化劑及質量濃度對3種外植體褐化率的影響Table 4 Effects of different concentrations of anti browning agents on the browning rate of 3 explants

表5 不同植物生長調節劑種類及質量濃度對愈傷組織誘導的影響Table 5 Effects of different hormone kinds and concentrations on callus induction

PVP為專一吸附酚類物質的常用吸附劑，能阻止酚類物質被氧化為醌類物質，可降低外植體褐化程度。檸檬酸通過抑制多酚氧化酶的活性來抑制褐化［11］。本研究發現：在接種前用1.0 g·L-1PVP浸泡香港四照花外植體能有效降低褐化率，在培養基中添加2.0 g·L-1PVP能明顯減輕莖段與帶芽莖段的褐化現象。嫩葉在添加1.0 g·L－1檸檬酸的培養基中褐化率最低，但檸檬酸遇高溫會產生酸性物質，影響培養基凝固，故需高壓滅菌后用注射器加入，不利于工廠化生產。硫代硫酸鈉與檸檬酸活性炭褐化效果不明顯，甚至在高質量濃度下加重了外植體褐化。這與在核桃楸Juglans mandshurica［12］和黑莓Rubus［13］上的研究結論不一致，可能因選用基本培養基不同，也可能是不同樹種差異性所致。

表6 不同植物生長調節劑種類及質量濃度對帶芽莖段誘導的影響Table 6 Effects of different hormone kinds and concentrations on the induction of stem segment with bud

圖2 3種外植體的誘導培養Figure 2 Induction of 3 explants

不同的外植體類型對該種植物的誘導培養有很大的影響。試驗結果表明：莖段是誘導愈傷組織的最佳外植體，而帶芽莖段誘導屬腋芽萌發，污染率及褐化率較低，最易萌發產生新芽；葉片褐化率較高，出愈率低于莖段，可能因其分化程度較高；試驗中發現少數帶芽莖段會在切口處長出奶黃色愈傷組織，但不影響帶芽莖段繼續萌發，故本試驗只統計其萌發率。

植物生長調節劑對外植體的形態建成及其調控起著重要作用。本試驗將組織培養中廣泛應用的3種植物生長調節劑組合使用，以期尋找最佳誘導培養基。結果表明：嫩葉最佳植物生長調節劑組合為：1.0 mg·L－16-BA+0.2 mg·L－1NAA+0.1 mg·L－12,4-D； 莖段與帶芽莖段的最佳激素組合均為： 2.0 mg·L－16-BA+0.5 mg·L－12,4-D。通過對正交試驗結果的直觀分析，2,4-D和NAA對嫩葉、莖段誘導愈傷組織的影響較大，而6-BA在誘導腋芽萌發具有突出的促進作用［14］。

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