高效液相色譜法測定頭痛寧膠囊中天麻素含量的不確定度評定

苑 博 馬海英 王 穎

（中國醫科大學附屬第四醫院藥學部，遼寧 沈陽 110032）

頭痛寧膠囊由天麻、土茯苓、制何首烏、當歸、防風和全蝎六味中藥制成，具有熄風滌痰、逐瘀止痛的功效，臨床效果顯著[1-3]。天麻為方中主藥，筆者建立了HPLC法測定頭痛寧膠囊中天麻素的含量，方法專屬性強、簡便快速、準確度高，可用于頭痛寧膠囊中天麻素的測定。測量不確定度是與測量結果準確度相關的參數，可以表征合理的測量結果的分散性[4-7]，可以綜合判定測量結果質量，評定測量條件和測量方法的可靠性，目前還沒有頭痛寧膠囊中天麻素含量不確定度文章報道。本研究結合CNAS-GL06-2006《化學分析中不確定度的評估指南》和JJF 1059.1-2012《測量不確定度評定與表示》中規定的程序，對高效液相色譜法測定頭痛寧膠囊中天麻素含量的不確定分析，對測量過程中影響測量結果的因素進行考察，分析了各不確定度分量對測量結果的影響，計算出測量結果的不確定度，為測量結果的評定提供可靠性依據。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥 Agilent 1200高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；電子分析天平（AL204型，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）； 超聲波清洗器（KQ-500DE型，昆山市超聲儀器有限公司）； 天麻素標準品（中國藥品生物制品檢定所，批號：110807）；乙腈（色譜純，美國Merck公司）；頭痛寧膠囊（陜西步長制藥有限公司，批號為170456）。其他試劑均為分析純。

1.2 色譜條件 色譜柱：Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈-0.1%冰醋酸 （2∶98（v/v））；流速1.0 mL·min-1；柱溫40℃；檢測波長220 nm；樣量20μL。

1.3 對照品溶液的制備 精密稱取天麻素對照品13.10 mg，置于10 mL容量瓶中用流動相溶解定容，制成濃度為1.31 mg/mL的天麻素對照品儲備液。分別取適量天麻素對照品儲備液用流動相稀釋成濃度為1.31、6.55、13.10、26.20、52.40和104.80 mg/L的天麻素對照品溶液。

1.4 供試品溶液的制備 取10粒頭痛寧膠囊內容物，混勻研細，精密稱取0.5 g置于25 mL容量瓶中，加入70%乙醇20 mL混勻，超聲波提取15 min，超聲波提取溫度為40℃，冷卻定容，過0.45μm濾膜，取續濾液作為供試品溶液。將對照品溶液和供試品溶液按照色譜分析條件分析，按外標法以峰面積計算天麻素含量。

2 結果

2.1 數學模型的建立與結果計算方法 用外標法計算頭痛寧膠囊中天麻素的含量，其數學模型見公式式中，X是頭痛寧膠囊中天麻素的含量（mg/g），C是天麻素色譜峰面積由標準曲線計算得到的天麻素濃度（mg/L），m為試樣質量（g），V為定容體積（mL）。天麻素濃度（C）與含量（X）之間存在線性關系，根據這一模型即可進行定量分析。

2.2 不確定度來源因果圖 從測量模型上分析，評估影響測量結果準確度的各個不確定度分量，如圖1所示。

圖1 高效液相色譜法測定頭痛寧膠囊中天麻素含量的不確定度來源

2.3 不確定度的來源識別 根據測定天麻素的數學模型分析，其測量不確定度主要有以下幾個環節引入，分別是由標準品溶液配制和稀釋、標準曲線擬合、樣品重復性測定、試樣稱量、試液定容和回收率引入的不確定度。

2.3.1 標準品溶液配制所引入的不確定度u1經查天麻素標準品證書上天麻素純度為（99.5±1.0）%，標準品純度所引入的不確定度。使用AL204型電子分析天平稱量天麻素標準品，稱量結果的示值誤差擴展不確定度由天平的校準證書獲得U=0.05 mg（k=2），標準品質量為13.10 mg，則天平稱量不確定度為。使用10 mL容量瓶對標準品溶液定容，由校準證書可知，擴展不確定度U=0.01 mL（k=2），由容量瓶定容引入的不確定度。綜合以上結果，標準溶液配制所引入的不確定度

2.3.2 標準品溶液稀釋所引入的不確定度u2標準溶液采用5 mL移液管轉移稀釋，查移液管的標準證書，其擴展不確定度U=0.005 mL（k=2），由移液器所引入的不確定度。10 mL容量瓶所引入的不確定度。綜合以上結果，標準溶液稀釋所引入的不確定度。

2.3.3 標準曲線擬合引入的不確定度u3以天麻素標準品溶液稀釋配制的6種標準品溶液 (m=6)的擬合標準曲線，每個標準溶液測定3次 (n=18)，擬合得線性回歸方程A=KC+b（K為1397.3，b為5.9771），相關系數為0.9998。取某標準品液重復測定3次計算出平均質量濃度C0=6.55 mg/L。繪制標準曲線的標準品濃度和響應值見表1，經計算標準液峰面積殘差的標準差式中為不同濃度標準品溶液的響應值， 為根據標準曲線算出的理論響應值，n為標準曲線的點數。因此，由天麻素的標準曲線擬合引入的不確定度可表示為，其中p為對C0的測定次數，c為標準品溶液的平均濃度。由標準曲線擬合引入的相對標準不確定度為。

表1 標準品溶液測量結果

2.3.4 樣品重復性測定引入的不確定度u4按照1.4項下實驗方法對樣品平行操作，進行了8次重復測定，測定結 果 為 1.281、 1.279、 1.283、 1.281、 1.278、 1.279、1.286和1.282 mg/g，平均值X=1.281mg/g，標準偏差為S（X） 0.003 mg/g，RSD為0.21%。由重復測定引入的相對標準不確定度。

2.3.5 樣品稱量引入的不確定度u5使用AL204型電子分析天平稱量樣品，由天平的校準證書獲得稱量結果的示值誤差擴展不確定度U=0.05 mg（k=2），樣品質量為500.0 mg，則天平稱量的相對標準不確定度為

2.3.6 樣品定容體積引入的不確定度u6使用25 mL容量瓶對樣品供試液定容，由校準證書可知，擴展不確定度U=0.01 mL（k=2），由容量瓶定容引入的不確定度。試驗時溫度控制在（20±5） ℃，假設溫度為矩形分布，溫度變化5℃引起的不確定度可由溫度范圍和體積膨脹系數計算，其中供試液的體積膨脹明顯大于容量瓶的體積膨脹，本次只考慮的體積膨脹，換算系數為 ，水的膨脹系數為2.1×10-4℃，溫度變化所引入的不確定度可表示為。因此樣品定容體積引入的相對標準不確定度

2.3.7 回收率引入的不確定度u7在頭痛寧膠囊中填加0.254 mg/g的天麻素標準品溶液，平行測定6次，經計算回收率結果為96.94%、96.17%、99.23%、98.47%、99.68%和100.29%，平均回收率R=98.46%。，由回收率引入的相對標準不確定度為。采用t檢驗法，對平均回收率進行顯著性檢驗，經查t檢驗臨界值分布表，t大于t95.5（2.58），回收率有顯著性差異，天麻素的含量需要校正才能得出更準確的結果。

2.4 合成相對標準不確定度和擴展不確定度 通過對各個不確定度分量的分析和計算，天麻素含量測定結果的合成相對標準不確定度為其合成不確定度可表示為mg/g。取95%置信水平，k=2，相對擴展不確定度為mg/g。實驗測得頭痛寧膠囊中天麻素的平均值為X=1.281 mg/g，則天麻素含量可表示為（1.28±0.027） mg/g。

4 總結

各不確定度分量對測量結果的影響各不相同，其中對測量結果影響較大的因素有標準品溶液配制、標準曲線擬合和回收率引入的不確定度。其次為稀釋定容和樣品重復性測定，試樣稱量引入的不確定度相對較小。因此在實際工作中做好工作曲線的繪制與擬合，測量結果進行回收率校正，可以有效地提高測量結果準確度。