愛羅咳喘寧對COPD大鼠細胞因子（IL-4、IL-12、INF-γ）的影響※

王 祎 陳婷婷 倪 普 朱一鳴 黃 華 馮宜飛 馮奕鵬 尚立芝張紅瑞

（河南中醫藥大學基礎醫學院，河南 鄭州 450046）

慢性阻塞性肺疾病 (chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是一種可以預防和治療的常見疾病，其特征是持續存在的、并呈進行性發展氣流受限[1]。COPD的發病機制尚未完全明了，目前普遍認為COPD是以氣道、肺實質和肺血管的慢性炎癥為特征，由多種炎癥細胞及炎癥介質參與且相互作用所致，中性粒細胞活化、聚集、釋放彈性蛋白酶等多種生物活性物質引起慢性黏液高分泌狀態并破壞肺實質。COPD的主要臨床表現為慢性咳嗽，咳痰，呼吸困難，常出現急性加重，多屬于中醫學“肺脹”“喘病”等范疇[2]。中醫認為，COPD多表現為肺、脾、腎三臟的虛損，而痰濁和瘀血在其發病過程中扮演了病理產物和致病因素雙重角色，互結為病，惡性循環，遷延難愈[3]。故而COPD的基本治法為化痰祛瘀，調暢氣機。愛羅咳喘寧中藥方劑有理氣化痰，止咳平喘，健脾固腎之效，經多年臨床和前期動物實驗研究結果顯示，愛羅咳喘寧口服液能顯著提高COPD患者和動物模型的肺功能，改善肺組織結構，但其作用機制不明[4]。白細胞介素4（IL-4）是由活化的Th2（Th2型反應，即體液免疫）細胞產生的一種細胞因子，而白細胞介素12（IL-12）是由活化的Th1（Th1型反應，即細胞免疫）細胞產生的細胞因子[5]。在COPD患者體內，Th2淋巴細胞產生的細胞因子降低，而Th1淋巴細胞產生的細胞因子升高[6-7]。同時，有研究顯示肺組織炎癥反應越嚴重，血清IFN-gamma、IL-12、Th1/Th2， 及肺組織中IFN-gamma的 mRNA與STAT4蛋白水平越高，而肺功能及血清IL-4、IL-13及肺組織中IL-4 mRNA水平越低[8]。因此，白細胞介素4（IL-4） 和白細胞介素12（IL-12）的分子學檢驗對于分析COPD患者的病程與轉歸有重要意義。干擾素-γ（INF-γ）是一種多功能的細胞因子，臨床研究表明，INF-γ具有抑制腫瘤生成、抗病毒、調節機體免疫力等作用[9]。處于急性加重期的COPD患者易在活化巨噬細胞作用下加快白細胞介素-12(IL-12） 的釋放速度，增加血液內IL-12濃度，進一步刺激巨噬細胞及T細胞，提高血液內INF-γ水平，加重肺部組織損傷嚴重，影響患者預后質量[10]。INF-γ直接參與COPD的發病過程，與患者病情發展程度呈正相關性，臨床應用價值較高[11-12]。本研究通過觀察愛羅咳喘寧對COPD大鼠支氣管肺泡灌洗液及肺組織勻漿中參與炎癥反應的白細胞介素-4（IL-4），白細胞介素-12（IL-12），干擾素-γ（INF-γ） 的影響，以期研究愛羅咳喘寧的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 7～8周齡SPF級wistar雄性大鼠60只，體質量（250±20） g。由河南省實驗動物中心提供，合格證號SYXY（豫） 2010-0001。

1.1.2 藥物 陳皮10 g(批號1502001H），茯苓15 g(批號1509001H），姜半夏10 g(批號1503001s），甘草6 g(批號1502001S）均選三九醫藥生產的中藥配方顆粒，紅旗渠香煙 (河南安陽廠，烤煙型，尼古丁含量1.1 mg/支，焦油含量14 mg/支），急支糖漿（太極集團重慶涪陵制藥廠有限公司，規格100 mL/瓶，批號15090660）。

1.1.3 試劑與儀器 大鼠IL-4酶聯免疫檢測試劑盒 (杭州聯科生物有限公司，批號230440715）、IL-12（北京誠林生物科技有限公司，批號201504）、INF-γ(上海邦奕公司，DRE20041）ELISA檢測試劑盒。紅旗渠牌香煙（河南安陽卷煙廠，烤煙型，尼古丁含量1.1 mg/支，焦油含量14 mg/支），脂多糖 (LPS，北京索萊寶科技有限公司，批號701C036）。小動物肺功能測量系統（德國leica公司）。BS210生物顯微鏡（麥克奧迪廈門銷售有限公司），BSA124S-CW型萬分之一天平 (德國賽多利斯），半自動輪轉式切片機 (德國leica公司，RM2245），DB-B1型烤片機 (上海雙旭電子有限公司），XH-C旋渦混合器 (常州金壇精達儀器有限公司），B11-3型磁力攪拌器 (上海司爾儀器有限公司），DHP-9050B智能型電熱恒溫培養箱（上海浪軒實驗設備有限公司），ZWY-240型恒溫搖床 (上海智誠），BCD-206YH型海爾冰箱(青島海爾股份有限公司）等由河南中醫學院科研試驗中心提供。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 將60只大鼠隨機分為6組：正常對照組，模型組，愛羅咳喘寧低、中、高劑量組和急支糖漿組，每組10只。

1.2.2 模型制備 采用香煙煙熏4周加氣管內滴注脂多糖（LPS）2次的復合因素復制COPD穩定期肺氣虛證大鼠模型。實驗第1、14日，麻醉，暴露氣管，1 mL注射器預裝200μL的LPS注入氣管內，立即豎起大鼠旋轉，以防窒息并使LPS均勻分布于兩肺。實驗第2～13日、15～28日將大鼠置于密閉煙室（側面開直徑0.5 cm2通氣孔），50 mL針筒抽取紅旗渠香煙煙霧注入密閉熏煙箱內，保持煙霧濃度為5%，每日0.5 h。正常對照組不予煙熏，但采用LPS注入相同的方法氣管內注入等量的生理鹽水代替LPS。

1.2.3 給藥方案 愛羅咳喘寧組中劑量組按正常劑量生藥量4.9 g/kg（稀釋成6 mL）灌胃，高劑量組按9.8 g/kg（稀釋成6 mL）灌胃，低劑量組2.45 g/kg（稀釋成6 mL）灌胃，每天2次，10AM與4PM各給藥1次。急支糖漿組給予急支糖漿口服液每天3 mL（稀釋成6 mL），分2次灌胃（按中劑量組成人用量7倍折算）；空白對照組及模型組給予同等劑量（6 mL）的生理鹽水灌胃。以上各組連續灌胃14 d。

1.2.4 檢測指標 （1）大鼠的一般狀態：包括皮毛、體重、飲食情況、活動度、死亡情況；（2） 肺功能測定：潮氣量（Tidal volume，TV）、呼氣峰流速（Peak expiratory flow，PEF） 和50%潮氣量呼氣流量（Expiratory flow at 50%of lung volume，EF50）； （3） 血常規檢查；（4）ELISA檢測支氣管肺泡灌洗液及肺勻漿中INF-γ、IL-4、IL-12的含量；（5） 病理切片觀察 （固定，脫水，二甲苯透明，石蠟包埋。連續冠狀切片，HE染色，光鏡下觀察病理變化）；（6）免疫組化檢測肺組織中INF-γ的表達（①切片脫蠟至水；②過氧化物酶阻斷；③抗原熱修復；④滴加封閉液；⑤滴加一抗，4℃過夜；⑥滴加山羊抗兔IgG；⑧滴加試劑SABC；⑨DAB顯色，蘇木素復染）。

1.2.5 統計學方法 數據處理采用SPSS 13.0統計學軟件統計分析，定量資料采用均數±標準差（x±s）描述，組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗，相關性檢驗用Spearman等級相關分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 愛羅咳喘寧對大鼠一般狀況的影響 正常組大鼠無死亡，精神狀況佳，活動靈敏，毛色乳白有光澤，大、小便無異常。造模初期，第1～14天時，造模的大鼠出現不同程度的抵抗及煩躁，第15天后神情倦怠，體型消瘦，毛色略黃無光澤，體重下降，飲食量及飲水量減少，大便稀而致墊料潮濕，可聞及呼吸音增粗、呼吸頻率增快、咳嗽、氣喘、鼻部可見淺黃色分泌物等。灌胃后，治療組的以上癥狀呈不同程度的改善，其中愛羅咳喘寧中劑量組的癥狀改善最為明顯。其他各組均死亡2只大鼠。

2.2 各組肺功能比較 與正常組比較，模型組大鼠用力肺活量（Forced vital capacity，FVC）、1秒鐘用力呼吸容積（Forced expiratory volume in one second，FEV1），以及FEV1/FVC均顯著變小（P<0.05）；與模型組比較，愛羅咳喘寧高、中劑量組FVC、FEV1，FEV1/FVC均不同程度增大（P<0.05），見表1。

表1 愛羅咳喘寧對各組大鼠肺功能的影響 （x±s）

2.3 愛羅咳喘寧對肺勻漿中INF-γ、IL-4和IL-12含量的影響 模型組肺勻漿中INF-γ、IL-4和IL-12含量均顯著高于正常組（P<0.01，P<0.05）。

與模型組比較愛羅咳喘寧中、高劑量組中INF-γ、IL-4和IL-12均顯著減少 （P<0.01，P<0.05）。

免疫組化檢測肺組織中INF-γ表達，模型組INF-γ表達顯著強于正常組。愛羅咳喘寧中、高劑量組中INF-γ表達較模型組減弱。見表2。

表2 愛羅咳喘寧對肺勻漿中INF-γ，IL-4和IL-12含量及INF-γ表達的影響 （x±s）

2.4 愛羅咳喘寧對肺組織結構的影響 正常組肺組織結構完整，肺泡腔內無滲出物。模型組肺內細支氣管內有痰，肺泡上皮細胞不同程度的損傷，肺泡中有滲出液及炎細胞，肺泡間質炎細胞浸潤明顯，局部有肺大泡（肺氣腫形成）。愛羅咳喘寧中、高劑量組和急支糖漿組炎癥明顯減輕。見圖1。

2.5 免疫組化檢測肺組織中INF-γ的表達 與正常組比較，模型組INF-γ表達明顯增強，INF-γ陽性表達信號定位于肺泡上皮細胞胞漿和巨噬細胞胞漿。與模型組比較，愛羅咳喘寧中、高劑量組INF-γ表達顯著增強。各組表達強度見表2，圖2。

圖1 各組肺組織結構改變（HE，×200）

3 討論

本研究結果顯示，與正常組比較，模型組大鼠FVC、FEV1，以及FEV1/FVC均顯著變小；與模型組比較，愛羅咳喘寧高、中劑量組FVC、FEV1，FEV1/FVC均不同程度增大，提示愛羅咳喘寧能改善COPD大鼠肺功能。基于此，該研究考慮可以用炎癥細胞因子及其受體蛋白等生物指標來反映COPD患者的臨床肺功能。血清IL-6、TNF-α、INF-γ等炎癥介質的表達水平均同COPD合并肺部感染呈顯著相關性，臨床可將其作為評估患者病情發展、預測其預后質量的重要依據，全面提升診療針對性及有效性。模型組肺勻漿中INF-γ、IL-4和IL-12含量均顯著高于正常組。通過各組對肺勻漿中INF-γ、IL-4和IL-12含量的比較，與模型組比較，愛羅咳喘寧中、高劑量組中INF-γ、IL-4和IL-12均顯著減少。免疫組化檢測肺組織中INF-γ表達，模型組INF-γ表達顯著強于正常組。愛羅咳喘寧中、高劑量組中INF-γ表達較模型組減弱。肺組織結構光鏡下顯示，正常組肺組織結構完整，肺泡腔內無滲出物。模型組肺內細支氣管內有痰，肺泡上皮細胞不同程度的損傷，肺泡中有滲出液及炎細胞，肺泡間質炎細胞浸潤明顯，局部有肺大泡（肺氣腫形成）。愛羅咳喘寧中、高劑量組和急支糖漿組炎癥明顯減輕。免疫組化檢測肺組織中INF-γ的表達，與正常組比較，模型組INF-γ表達明顯增強，INF-γ陽性表達信號定位于肺泡上皮細胞胞漿和巨噬細胞胞漿。與模型組比較，愛羅咳喘寧中、高劑量組INF-γ表達顯著減弱，提示愛羅咳喘寧可能通過抑制INF-γ的表達而對抗炎癥反應。

綜上所述，與正常組相比，模型組中INF-γ，IL-4和IL-12含量高于正常組，提示INF-γ，IL-4和IL-12均參與COPD病理過程。愛羅咳喘寧對COPD干預有效，其機制可能通過抑制INF-γ，IL-4和IL-12的合成與分泌而阻滯COPD炎癥過程。其詳細機制有待深入研究。