華南地區漢族人群ABCG2基因多態性與原發性痛風的相關性

羅藝，張洪德，陳思祖，徐文莉，李康，廖長征

(深圳市龍崗中心醫院中心實驗室，廣東 深圳 518116)

痛風是尿酸鹽結晶沉積于關節及其周圍結締組織而引起的最常見的炎性關節炎[1－4]，其根本原因是由于嘌呤代謝紊亂造成血尿酸水平過高或（和）尿酸排泄減少，病變主要發生在關節軟骨、滑膜、骨骺、肌腱、以及血管較稀少的膠原纖維組織和腎臟等部位。流行病學調查顯示：痛風發病率急劇升高并呈低齡化趨勢[5]。研究表明，遺傳是原發性痛風發病的重要因素之一，10%～35%的痛風患者具有家族史，且患痛風者家族成員中無癥狀高尿酸血癥發生率約為25%～70%[6]。ABCG2是一種ATP結合轉運蛋白，廣泛分布于具有分泌、排泄功能的組織中，其功能異常可導致尿酸排泄能力下降[7]。亞洲、白種、非洲人群中，ABCG2與高尿酸血癥和痛風的最強關聯位點均為rs2231142位點，該位點可引起ABCG2蛋白141位谷氨酰胺轉變為賴氨酸 (Q141K)。高分辨率熔解曲線技術(high resolution melting，HRM)是一種利用熔解溫度判斷產物序列的技術，借助嵌入式飽和染料對DNA有較強結合能力和很低抑制作用的特點，可實現對擴增片段序列低至1個堿基改變的高靈敏檢測能力[8]。PCR產物的GC含量、長度、序列以及雜合情況決定了擴增片段熔解溫度及熔解曲線的形狀，現已廣泛用于檢測基因突變與分型的分子診斷、人類多種疾病相關遺傳多態性分析等方面。目前，已有文獻報道不同地域人群rs2231142位點單核苷酸多態性與痛風的相關性，而華南地區人群尚無文獻報道，因此本文采用HRM技術分析rs2231142基因位點，研究其與原發性痛風相關性，為痛風的防控與治療提供參考。

1 資料與方法

1．1 一般資料 痛風組426例樣本均選自2016年5月至2016年10月期間就診于自深圳市龍崗中心醫院門診的男性患者（21～65歲），所有患者均符合美國風濕病協會制定的痛風診斷標準；對照組200例樣本均選自本院體檢科就診健康男性，排除惡性腫瘤、高尿酸、高脂血、高血壓、痛風、糖尿病等疾病。本研究已通過本院倫理學委員會批準，所有參與本研究患者均知悉本試驗目的。測量所有受試者血壓、體重和身高并計算出體重指數。采集空腹靜脈血，檢測血清尿酸、尿素氮、肌酐、總膽固醇、甘油三酯、血糖等生化指標。

1．2 試劑與儀器

1．2．1 核酸提取與純度檢測 全血DNA抽提試劑盒(杭州博日)；DNA濃度與純度檢測使用DN－1000（美國 Thermo Scientific）。

1．2．2 生化指標檢測 C702全自動生化分析儀（瑞士Roche）

1．2．3 引物合成與PCR擴增 引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成；MeltDoctor HRM Master Mix試劑盒(美國Life Technologies)；PCR擴增儀為ViiA7實時熒光定量PCR儀(美國ABI)。

1．3 方法

1．3．1 樣本處理 采集 5ml EDTA抗凝外周靜脈血，取200μl抽提全血基因組DNA（操作步驟嚴格參照說明書），并測定DNA濃度與純度，保證核酸純度相同的條件下使用TE緩沖液稀釋至相同DNA 濃度(50ng/μl)，置 4℃保存備用。

1．3．2 引物設計與 PCR擴增 使用Primer3軟件，根據rs2231142位點設計引物（見表1）并合成。使用MeltDoctor HRM Master Mix試劑盒，反應體系為：2X MeltDoctor HRM Master Mix 12．5μl，上游引物 0．5μl、下游引物 0．5μl、非標記探針 0．5μl、DNA樣本1μl，去離子水補足體系總體積25μl，使用熒光定量PCR儀按照以下反應條件擴增：Taq酶熱啟動（95℃，10min）；變性（94℃，30s）；退火（58℃，30s）；延伸（72℃，30s）；循環 35 次，72℃終末延伸5min。在60℃～95℃進行高分辨率熔解曲線分析，溫度每上升1℃采集25次熒光信號。當擴增模板上存在堿基突變時，熔解溫度和熔解曲線形狀與野生型的樣本即會產生差別，分別設置已知型別的DNA模板作為標準對照品，通過將未知樣本HRM圖譜和標準品比對，即可得出樣本基因型，由此可實現對已知位點的單核苷酸多態性（Single nucleotide polymorphism，SNP）和突變進行基因分型。表1所示ABCG2基因rs2231142位點的擴增引物

表1 PCR反應引物及非標記探針序列

1．4 統計學處理 數據分析使用SPSS 19．0軟件；正態分布資料用（±s）表示；兩組間數據比較采用t檢驗；兩組間基因型和等位基因構成比采用χ2檢驗；擬合優度χ2檢驗對痛風組、對照組SNP位點進行 Hardy－Weinberg 平衡檢驗；P＜0．05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2．1 rs2231142基因分型檢測結果 將樣本DNA擴增產物的HRM圖譜與已知基因型的標準品圖譜進行比對，即可知道該樣品的基因型：若某個樣本僅有C等位基因的Tm值，即為CC型；僅含有A等位基因的Tm值，即AA型；若某樣本既含有C等位基因又有A等位基因的Tm值，即為雜合型A/C。

圖1 高分辨率熔解曲線rs2231142基因分型

2．2 rs2231142基因型與痛風發病相關性分析表2所示為對照組與痛風組rs2231142基因型與等位基因分布的對比情況，采用擬合優度χ2檢驗顯示病例對照組中SNP位點基因型分布符合Hardy-Weinberg 遺傳平衡定律(P＞0．05)；對照組與痛風組CC、A/C、CC 基 因 型 攜 帶 頻 率 分 別 為 ：59．98%、31．02%、9．00%和 30．05%、52．82%、17．14%，對照組與痛風組各基因型攜帶頻率差異具有統計學意義（P＜0．01）；痛風組 rs2231142 A 等位基因攜帶頻率為 43．54%，對照組為 24．05%，差異有統計學意義(P＜0．01)；AA基因攜帶者與A等位基因攜帶者痛風對比CC基因攜帶者與C等位基因攜帶者發病風險性分別提高了3．802倍和2．377倍，提示該基因位點與華南地區人群原發性痛風具有相關性。

2．3 rs2231142位點與痛風相關生理及生化指標關聯性 rs2231142基因型與痛風相關生化指標進行了單因素方差分析，結果如表3所示，rs2231142多態性與收縮壓、尿素氮、肌酐、尿酸等生化指標具有相關性。

3 討論

高尿酸血癥(Hyperuricemia，HUA)是引起腎臟損害的重要因素之一，與糖、脂代謝紊亂關系密切，是心血管疾病的獨立危險因素。流行病學調查顯示HUA患病率呈逐年上升趨勢，目前我國HUA患者約1．2億，約占總人口的10%。HUA與痛風的遺傳模式十分復雜，是由若干主效基因和多個微效基因共同控制并與環境相互作用而產生[4，9]。閻勝利[10]等調查顯示山東沿海地區40～49歲男性痛風患病率最高，尤其南方及沿海經濟發達地區HUA 患病率可高達 5．0%～23．5%，且呈現年輕化的趨勢，其原因可能與該地區居民攝入過多高嘌呤的海產品、動物內臟、肉類食品以及大量飲用啤酒等因素有一定相關性。ABCG2大量表達于腎近曲小管刷狀緣膜上，起到排泄尿酸的作用，ABCG2基因Gln141賴氨酸位點基因突變已被證實為病因學突變。ABCG2基因賴氨酸等位基因編碼的分子能夠使尿酸轉運能力下調約50%[11]，導致核苷酸結合結構域不穩定，從而引起蛋白質的表達降低[12]。Matsuo等[13]對705名日本痛風男性患者及1887名健康對照男性的發病年齡與基因分型進行分析，結果顯示ABCG2功能嚴重失活者的痛風發病年齡較ABCG2功能正常者提前6．5年。多項研究[14－15]顯示rs2231142多態性位點是一個重要的痛風發病遺傳標志。Wang等[16]研究顯示，中國漢族男性ABCG2 rs2231142位點AA基因型攜帶者痛風發病率對比CC基因型痛風發病率顯著增高，表明該位點基因多態性與中國漢族男性原發性痛風的發病關系密切。因此，本研究僅選取男性作為研究對象。

表2 痛風組與健康對照組的rs2231142的等位基因和基因型分布例（%）

表3 rs2231142基因型與痛風相關生化指標的關聯性

本研究選取626例華南地區漢族人群作為研究對象，結果顯示ABCG2基因rs2231142位點，痛風患者攜帶高風險基因型 （AA+A/C）的比率為69．96%， 正常人群僅為 40．02%；rs2231142 基因位點各基因型在正常人和痛風患者攜帶頻率差異均具有統計學意義（P＜0．01）。針對發病風險評估發現AA基因型攜帶者痛風發病風險較CC基因攜帶者提高3．802倍，A等位攜帶者發病風險與C等位基因攜帶者相比提高了 2．377倍。ABCG2基因的rs2231142位點多態性還影響收縮壓、尿素氮、肌酐、尿酸等指標，此結果可解釋痛風患者為何常合并代謝紊亂、高血壓等疾病，但相關作用機制還需作深入探討。本文所采用的HRM技術，僅需在反應體系中增加飽和熒光染料，不需使用探針即可進行基因分型，該方法實現閉管操作，有效降低污染；同時只需要一種試劑在同一平臺上進行基因分型和突變掃描，因此，該技術具有操作簡單、成本低廉、耗時少、誤差小、高通量等優點，可將其作為痛風SNP位點快速篩查方法并推薦廣泛應用于臨床。