微生態制劑在對蝦病害防控中的應用開發進展

董小林，趙 敏，陳家林，劉家壽，錢雪橋

( 1.廣東海大集團股份有限公司 畜牧水產研究中心, 農業部養殖用微生態資源與利用重點實驗室，廣東 廣州 511400;2.中國科學院 水生生物研究所, 湖北 武漢 430072) )

1 對蝦養殖病害現狀及措施

1.1 對蝦養殖的病害威脅

我國養殖產量較多、經濟價值較高的對蝦有凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)、斑節對蝦(Penaeusmonodon)、日本囊對蝦(Marsupenaeusjaponicas)、中國明對蝦(Fenneropenaeuschinensis)、長毛明對蝦(F.penicillatus)、墨吉明對蝦(F.merguienrsis)等[1]。但是目前養殖病害已經成為制約對蝦產業發展的重要障礙，其中細菌性疾病是最主要的對蝦疾病之一，尤其弧菌病是當前造成蝦苗死亡的重要原因[2]。大量應用抗生素和消毒劑控制疾病會造成藥物殘留、細菌耐藥性轉移、生物抵抗力下降等嚴重后果[1,3]，歐洲許多國家已經明令禁止或限制抗生素在養殖業中的使用。相關法律法規和養殖環境的雙重壓力會使得抗生素或治療型化學藥物在水產養殖業上的應用越來越少，開發無藥殘、抗菌譜廣、安全性高的免疫增強劑是當前對蝦養殖業關注的重點。

1.2 對蝦的免疫系統及免疫強化措施

對蝦的免疫系統主要包括免疫器官(甲殼、鰓、血竇、淋巴器官)、免疫細胞(血細胞和淋巴細胞)和各種免疫因子(免疫相關的多肽和蛋白)[4]。對蝦屬低等無脊椎動物，主要依靠非特異性免疫系統來抵御感染，包括細胞免疫系統和體液免疫系統。其中血淋巴細胞在其免疫防御中起主導作用，細胞通過黏附作用、吞噬作用、趨化作用、包裹作用等過程直接參與免疫反應。體液免疫系統包括酚氧化酶系統、溶菌酶、過氧化物酶、超氧化物歧化酶、堿性磷酸酶和酸性磷酸酶。此外，凝集素、抗菌素、抗菌肽、活性氧等免疫因子也參與免疫反應。細胞免疫和體液免疫作用緊密相關，血細胞可合成并釋放體液免疫因子，細胞免疫反應又受到體液免疫因子的介導和影響[5]。

一般使用一些免疫刺激劑來預防疾病。這類物質分為三類：營養物質的間接作用、特異性作用的疫苗、非特異性的免疫增強劑[1]。接種疫苗是目前漁業生產上預防傳染性疾病最為有效的辦法，但是對于特異性免疫系統不夠發達或缺乏的蝦類作用非常有限；而一些源自微生物細胞壁成分的免疫增強劑等有很強的劑量依賴性而難以把握。微生態制劑可以通過刺激非特異性免疫系統來提高動物的免疫力和對傳染性疾病的抵抗力，這種免疫沒有記憶且持續時間較短，比抗生素更安全，比疫苗作用更廣泛。應用益生菌防治對蝦疾病很有應用前途，相關研究已取得了顯著成績。

2 微生態制劑在對蝦病害防控中的研究進展

2.1 對蝦腸道菌群組成的研究是開發益生菌的基礎

對蝦腸道微生物多樣性的研究是開發應用微生態制劑的基礎。陸地養殖動物的常駐菌群則主要是革蘭氏陽性的專性或兼性厭氧菌，如乳酸菌和鏈球菌等；而水產動物消化道的常駐菌群主要為革蘭氏陰性的兼性厭氧菌，如甲殼類的常駐菌群是弧菌和假單孢菌。因為畜禽均為恒溫動物，其消化道界面的溫度、pH、氧化還原電位和滲透壓等均相對較為穩定，而水產動物是變溫動物, 在攝食和運動過程中，其消化道內外的微生物區系會不斷受到水流的驅動[3]。這種生理上的差異就決定了水產動物消化道內的微生物區系穩定性不比人或畜禽，且隨著水產動物的發育、季節的更替和環境的變化而發生顯著變化。

早期主要采用傳統的培養法研究對蝦腸道微生物，近年來分子方法開始被大多數人采用。普遍認為，水生無脊椎動物腸道微生物主要有弧菌(Vibrio)、假單胞菌(Pseudomona)、氣單胞菌(Aeromonas)、黃桿菌(Flavobacterium)和微球菌(Micrococcus)。早在20世紀80年代，Yasuda等[6]就分析了日本囊對蝦不同發育階段腸道菌群的組成，結果表明，溞狀幼體階段腸道菌群的優勢菌群為弧菌屬；成蝦階段為假單胞菌屬；成長較差的成蝦其腸道中有大量的氣單胞菌和弧菌。Moss等[7]發現，對蝦腸道優勢菌為弧菌屬、氣單胞菌屬和假單胞菌屬。王祥紅等[8]發現，弧菌屬和發光桿菌屬(Photobacterium)在野生中國明對蝦腸道中為優勢菌屬。劉淮德等[9]指出中國明對蝦腸道微生物主要由弧菌、光合細菌、不可培養細菌組成；弧菌為優勢菌。Chaiyapechara等[10]從泰國8個養殖場取樣70尾斑節對蝦幼蝦，采用PCR梯度變性凝膠電泳和16S rDNA技術測定了腸道菌群的組成。結果表明，腸道細菌的常見細菌均屬于γ-變形菌門，每個蝦場對蝦的腸道優勢菌群各不相同，分別屬于弧菌屬、發光桿菌屬、氣單胞菌屬、丙酸桿菌屬(Propionibacterium)；且不同養殖水體中的對蝦其腸道菌群的結構差別很大。

2.2 益生菌的篩選及應用效果研究成果

引起對蝦病害的主要細菌為革蘭氏陰性菌，包括弧菌、假單胞菌、黃桿菌、氣單胞菌和交替單胞菌(Alteromonas)等，其中以弧菌為主[1]。病原性弧菌主要有哈氏弧菌(V.harvey)、副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)、溶藻弧菌(V.alginolyticus)、鰻弧菌(V.anguillarum)等。研究表明，益生菌制劑可以改善對蝦的腸道微生態構成，提高對蝦生長率、成活率、免疫力及抗病力等。有益菌的抗病保護作用主要是通過以下兩種途徑：一是激活細胞和體液免疫系統，從而提高蝦體的免疫力；二是通過在蝦消化道中的競爭排斥作用減少腸道中的有害菌群，降低其致病機會。益生菌的競爭排斥和免疫刺激是對抗病原的有效機制[11]。還有研究表明，一些益生菌能阻止并修復由來自食物的抗原或藥物作用引起的黏膜層損害[12]。此外，益生菌還可以產生一些消化酶類，增強機體的消化能力，提高抗應激能力和健康狀況。

用陸生生物的細菌作為水生動物的益生菌往往效果并不理想，這是因為菌株的生理生化特性具有環境依耐性[13]。因此許多從蝦塘或蝦的腸道及肝胰腺中分離益生菌菌株的報道大量涌現。筆者重點介紹對蝦益生菌的候選菌株、作用機制及其在對蝦養殖應用上的挑戰，為對蝦益生菌產品的應用開發提供參考。

2.2.1 芽孢桿菌

革蘭氏陽性菌，尤其是芽孢桿菌(Bacillus)可以產生大量的蛋白酶和淀粉酶等胞外酶，在對蝦中應用可增加腸道脂肪酶、蛋白酶和淀粉酶的活性，提高對蝦飼料的消化率；但是很難對蝦體自身消化酶和芽孢桿菌胞外酶進行區分和定量[14]。Ziaei-Nejad等[15]評價了芽孢桿菌屬的益生菌對對蝦消化酶活性、生長和存活的影響，表明芽孢桿菌產生的酶類能有效將碳水化合物、脂類和蛋白降解成小分子物質。雖然芽孢桿菌分泌大量胞外酶的優勢特性是其被關注的重點，但是其對對蝦病原性弧菌的拮抗作用也有較多的報道，Vaseeharana等[16]指出枯草芽孢桿菌(B.subtilis)BT23在實驗室條件下能抑制病原性弧菌。Balcázar等[17]從凡納濱對蝦腸道分離到的枯草芽孢桿菌UTM126對對蝦的致病菌副溶血弧菌PS-017有明顯的拮抗作用。但是體外拮抗效應并不能反映體內對病原菌的抑制效果，因此通過活體試驗評價芽孢桿菌對病原性弧菌的抑制功效具有重要意義。

Rengpipat等[11,18]研究表明，飼喂芽孢桿菌S11菌株時斑節對蝦生長良好，抗菌能力增強，受到107個/mL 致病菌哈氏弧菌的人工感染以后，其存活率顯著高于對照組。Gullian等[19]從凡納濱對蝦中腸腺分離出益生菌芽孢桿菌P64菌株，對哈氏弧菌S2的抑制率為34%，在對蝦肝胰臟的定殖率為58%，表明該菌株具有益生菌和免疫刺激劑特性。Balcázar等[17]從凡納濱對蝦腸道分離到的枯草芽孢桿菌UTM126對對蝦的致病菌溶藻弧菌、副溶血弧菌和哈氏弧菌均有明顯的拮抗作用。飼喂含有105cfu/g益生菌的飼料28 d后，用105cfu/mL的哈氏弧菌浸泡攻毒，其死亡率僅為18.25%，顯著低于對照組的51.7%。朱學芝等[20]在基礎飼料中添加1010cfu/g的枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌(B.lincheniformis)飼喂初始體質量約4.5 g的凡納濱對蝦，40 d后用107cfu/mL溶藻弧菌水浴攻毒。結果表明，芽孢桿菌能顯著提高凡納濱對蝦血細胞總量及血清酚氧化酶、堿性磷酸酶和酸性磷酸酶的活性，增強其免疫機能；攻毒14 d內，對照組的累計病死率顯著高于試驗組。王玲等[21]的研究表明，在飼料中添加600 mg/kg的枯草芽孢桿菌制劑BS3755(2×109cfu/g)可以顯著提高凡納濱對蝦的生長率，降低飼料系數，并可以提高其非特異性免疫力(酸性磷酸酶、酚氧化物酶)。Liu等[22]從健康的凡納濱對蝦腸道中分離到枯草芽孢桿菌S12菌株。將此株菌以5×109cfu/kg、5×1010cfu/kg、5×1011cfu/kg、5×1012cfu/kg的劑量添加到對蝦飼料中，可顯著提高對蝦的生長和存活率；4周和8周時用哈氏弧菌攻毒的結果顯示，益生菌組的死亡率低于空白對照組。Hao等[23]表明, 凡納濱對蝦攝食含添加蠟質芽孢桿菌(B.cereus)D4(107cfu/g)的飼料時，生長性能顯著提高；非特異性免疫性能如超氧化物歧化酶、呼吸爆發、酸性磷酸酶活性等均比對照組增強；用哈氏弧菌攻毒后，處理組的死亡率顯著低于對照組。Niu等[24]發現芽孢桿菌LT3能夠在對蝦腸道中定殖，激活酚氧化酶原系統，提高機體的免疫應答，進而提高了對蝦對抗坎氏弧菌(V.campbellii)的能力。

許多情況下直接在養殖水體中添加有益微生物，利用其拮抗病原、降解多余有機質等，對養殖動物產生有益的影響。芽孢桿菌在對蝦養殖水體中的應用非常廣泛，有關在蝦池中施用芽孢桿菌對水體和對蝦腸道菌群、對蝦免疫機能和抗應激能力的影響也有較多報道。李卓佳等[25]對凡納濱對蝦的研究結果表明，施用芽孢桿菌制劑的蝦池對蝦腸道可培養細菌數量為3.4×107cfu/g，優勢菌群為弧菌屬和發光桿菌屬；未施用益生菌的蝦池細菌數量為5.8×1012cfu/g，優勢菌群為假單胞菌屬和弧菌屬。蝦池施用芽孢桿菌制劑，可促進養殖對蝦腸道微生物群落的代謝功能。Liu等[26]將一株自人類健康食品納豆中分離到的枯草芽孢桿菌E20應用到凡納濱對蝦的育苗水體中，添加枯草芽孢桿菌E20 109cfu/L可以明顯加快幼蝦的發育，提高存活率；枯草芽孢桿菌E20還降低了水體的細菌總數和弧菌數；在進行溫度、鹽度、氨氮脅迫時，益生菌組的后期幼體的累計死亡率明顯低于對照組，免疫相關酶基因表達顯著高于對照組。Zokaeifar等[14,27]研究發現，將分離到的枯草芽孢桿菌L10和G1分別以105cfu/mL和108cfu/mL的劑量添加至凡納濱對蝦的養殖池水中，水體的氨氮、亞硝酸鹽顯著降低；對蝦的特定生長率、飼料利用以及存活率均顯著提高；8周以后用哈氏弧菌ATCC14126攻毒，對照組的累積死亡率高達80%，而益生菌組的累積死亡率分別為36.7%和50%，說明枯草芽孢桿菌從多個角度改善了對蝦的生長性能、健康狀況和抗病力。

芽孢桿菌在對蝦養殖中經常被用于降低弧菌數量，對抗魚蝦的多種病原菌。考慮到芽孢桿菌屬的優勢特征，它們將是對蝦養殖病害防控上良好的益生菌候選菌[28]。

2.2.2 乳酸菌

乳酸菌類可分泌特殊產物，還具有細胞表面的蛋白抗原和黏液黏附受體蛋白等生理生化特征，已經作為益生菌廣泛應用于陸生動物和魚類養殖[29]。乳酸菌能使無菌動物和常規小鼠腸道絨毛膜層細胞增殖，也能通過提高腸上皮細胞的成活率使腸道黏膜層的損傷修復[30]。

Chiu等[31]指出飼喂含植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)的飼料，提高了凡納濱對蝦的免疫能力和抗弧菌感染能力，但是處理組的血細胞數降低。但實際生產過程中，水產飼料的調質制粒環節需要高溫高濕和高壓的條件(溫度90～105 ℃)，才能使得飼料中的淀粉適度熟化保證飼料的耐水性等要求；而乳酸菌對高溫等的抗逆性較差，在該加工溫度下基本已完全滅活，因此在一定程度上限制了其在水產飼料上的直接應用。Bussarin等[32]為了開發應用于凡納濱對蝦飼料中的耐熱益生菌候選菌株，從經過高溫處理后的健康對蝦中分離到2株乳酸菌菌株：腸道原著菌植物乳桿菌ID1L和外來菌乳酸短乳桿菌(L.brevis)860，它們均對弧菌等病原菌有拮抗作用；進一步研究這兩株乳酸菌的熱適應性能，并做現場飼料加工評價，證實該乳酸菌類在蝦料生產中采用高溫噴霧的方式可行。王國霞等[33]在凡納濱對蝦飼料中添加2.0×109cfu/mL的液體嗜酸乳桿菌(L.acidophilus)發酵72 h，投喂8周。試驗表明，10%乳酸菌添加可一定程度上提高凡納濱對蝦的生長性能和消化酶活性，改善其非特異性免疫力。

乳酸菌能夠產生抑制因子如細菌素以有效抑制革蘭氏陽性菌，但是水產養殖中很多病原菌是革蘭氏陰性菌，并且乳酸菌一般占水生動物腸道菌總數的約10%，其抗逆性也較差，因此乳酸菌在水產養殖上作為拮抗病原菌的益生菌的研究還有較大爭議[34]。盡管如此，由于乳酸菌具有分泌多種益生物質、修復腸道損傷、提高機體非特異免疫機能、改善消化吸收等功效，因此在對蝦的健康維護上具有突出效果，進而可以間接提高對蝦的抗病原菌能力。因此，乳酸菌在對蝦病害防控上的應用效果依然值得肯定，但是需要通過后噴涂、拌料、篩選耐高溫菌株等方式解決乳酸菌抗逆性差的問題。

2.2.3 弧菌

多種弧菌是對蝦的病原菌。盡管溶藻弧菌的一小部分菌株是病原菌，但它的大多數菌株有著獨特的生物特性。Adams[35]的研究發現，熱滅活的溶藻弧菌能激活部分斑節對蝦的非特異性免疫反應。Gullian等[19]從凡納濱對蝦中腸腺分離出益生菌弧菌P62和P63菌株，對哈氏弧菌S2的抑制率分別為54%和19%，在對蝦肝胰臟的定殖率分別為83%和60%，可能表現為益生菌特性而無免疫刺激特性。Alavandi等[36]從斑節對蝦的腸道中分離到河流弧菌(V.fluvialis)PM17作為益生菌的候選菌，因為該菌株的篩選標準是其產胞外酶和鐵載體的能力以及其生長特性，沒有考慮其對對蝦免疫力的提高，因此河流弧菌PM17的應用使斑節對蝦的血細胞數量、酚氧化酶活性和血淋巴抗菌活力隨著時間的延長卻逐漸下降。Balcázar等[17]證實從凡納濱對蝦腸道分離到的溶藻弧菌UTM102對對蝦的致病菌副溶血弧菌 PS-017有明顯的拮抗作用。

考慮到弧菌在對蝦養殖中的潛在病原特性，其益生菌菌株需要特別關注減低其轉化為病原菌的風險。

2.2.4 假單胞菌

假單胞菌是土壤、淡水和海水環境中的常見菌種，能夠產生大量的次生代謝產物抑制多種病原菌。假單胞菌和弧菌是對蝦養殖環境中的常見菌種。Chythanya等[37]篩選出一株對哈氏弧菌、河流弧菌、副溶血弧菌、美人魚弧菌(V.damsel)和創傷弧菌(V.vulnificu)均有抑制作用的假單胞菌I-2，其抑菌物質具有熱穩定性，溶于氯仿，耐受蛋白酶的小分子化合物。Alavandi等[36]從斑節對蝦的腸道中分離到假單胞菌PM11作為益生菌的候選菌。Vijayan等[38]從半咸水湖泊中分離到一株假單胞菌PS-102，該菌株能夠抑制多種對蝦和沼蝦養殖環境中的病原性弧菌，其對溫度、pH和鹽度的廣泛耐受也表明該菌株是對蝦養殖的優良益生菌候選菌。Balcázar等[17]從凡納濱對蝦腸道分離到的假單胞菌SLV22對對蝦的致病菌副溶血弧菌PS-017有明顯的拮抗作用。

2.2.5 其他益生菌

針對對蝦病原性弧菌的益生菌篩選有較多的研究，除了上述幾種外，還報道了其他一些益生菌候選菌株。李會榮等[39]從健康斑節對蝦幼體及其養殖環境中，分離出5 株對水產養殖動物病原菌哈氏弧菌和鰻弧菌等生長有抑制作用交替單孢菌。李繼秋[40]從中國明對蝦養殖水體中分離出一株煙草節桿菌(Arthrobaternicotianae)XE-7，其對副溶血弧菌、鰻弧菌和沙蠶弧菌(V.neresis)有明顯拮抗作用。XE-7抑制水體弧菌的效果與氯霉素相當；添加到飼料中能提高凡納濱對蝦的生長率和對副溶血弧菌的抵抗力。張新明[41]從健康的對蝦體內及養殖水體中篩選到對鰻弧菌H-2、副溶血弧菌1614、沙蠶弧菌1623、漂浮弧菌(V.natriegen)1594等病原菌有拮抗作用的6株海洋細菌，其中微球菌J-10對病原菌的拮抗作用最強。將J-10添加到飼料中投喂凡納濱對蝦，對蝦的酚氧化酶活性、抗菌活力和溶菌活力、溶血素活性、超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和血清蛋白含量等免疫指標均優于對照組。用副溶血弧菌進行人工攻毒，免疫保護率達到40%。Balcázar等[17]從凡納濱對蝦腸道分離到的玫瑰桿菌(Roseobactergallaeciensis) SLV03對對蝦的致病菌副溶血弧菌PS-017有明顯的拮抗作用。張玲[42]從耐受過白斑病毒的中國明對蝦腸道中分離到一株海洋細菌嗜鹽單胞菌(Halomonas)B12，并從免疫學、腸道微生物學和組織學的角度，探討其對對蝦的作用機理。結果表明，飼料中添加7.18×1010cfu/g的海洋細菌嗜鹽單胞菌B12顯著提高了中國明對蝦腸道總菌數，降低了腸道弧菌數，提高中國明對蝦幼體的成活率和對哈氏弧菌和副溶血弧菌的抗病力，改善了對蝦養殖水體水質。楊世平等[43]將從對蝦養殖水體中分離到的沼澤生紅冬孢酵母(Rhodosporidiumpaludigenum)添加到凡納濱對蝦基礎飼料中，顯著減少了對蝦腸道內弧菌數以及弧菌與總細菌的比例。Wen等[44]通過共培養及電鏡觀察表明，蛭弧菌(Bdellovibrio)DA5對溶藻弧菌有明顯的溶菌能力，試驗感染的凡納濱對蝦存活率較高。

2.3 益生菌的使用方法是提高其功效的關鍵

益生菌使用的劑量、時間、使用方法(飼入、浸泡、口服、投水)、生物條件等是影響益生素有效性的關鍵因素[3]。一般認為適宜的益生菌劑量為105cfu/mL以上，劑量過高或持續時間過長可能引起非特異性免疫系統的持續反應而形成免疫抑制[45]。需要強調的是，用益生菌防控病害應提前使用。一般來說，通過飼料攝入是益生菌使用方法中最為方便和實用的方式；浸泡法雖然效果較好，但是需要從蝦池中轉移蝦體，由此帶來的應激較大；口服法一般是做成保健劑，然后與飼料進行混合飼喂，勞動強度較大，因此養殖戶難以堅持執行；投水法是直接將益生菌投放在養殖水體中，由于水體環境復雜多變，因此效果極不穩定。因此，開發功能性益生菌飼料，是益生菌發揮良好效果的重要措施。

3 現狀與展望

目前對蝦中益生菌開發的研究大部分集中在對病原菌有顯著抑制作用或有效提高蝦體非特異性免疫機能的益生菌候選菌的篩選上，大多菌株來自蝦塘水體或底泥、對蝦腸道或肝胰腺，不過也有少數學者從發酵的泡菜等其他途徑篩選對抗弧菌的益生菌菌株。篩選到的菌株需要進行安全性評估、藥敏試驗、抗逆性試驗、生長特性評價和優化等一系列的評估[46]。而提高候選菌株的抗逆性是飼用益生菌面臨的最大難題。

而評價益生菌的應用效果，一般采用微生物學、微生物生態學、組織學、免疫學、生理學和營養學等方法，探討益生菌的有益作用機制，包括生長和消化(消化酶、消化率、飼料轉化率)、免疫指標(血細胞數、酚氧化酶活性、血漿蛋白濃度、超氧化物歧化酶、細胞吞噬率、抗菌活性、呼吸爆發活性等)、抗病力(注射或浸浴病原菌)、對腸道菌群和腸道組織的影響、對水質和水體菌群組成的影響等。研究益生菌抗病效果，一般采用典型病原菌攻毒法。對病原菌菌株的選擇要有針對性，且最好探討對多種病原的免疫力，因為實際生產中的病害爆發并不是某一種病原菌所致。益生菌的作用位點是腸道，對腸道的評價對于揭示益生菌的作用機理至關重要[47]，但是由于腸道環境的復雜，研究繁瑣，使得益生菌對機體腸道的作用機理研究較少，僅對益生菌腸道細菌總數、異養菌數量、病原菌數量等的影響進行了簡單的比較研究，有關體內的作用機制尚不清楚。

益生菌對對蝦疾病和健康的調控效力已經比較確定[48]。但是受陸生動物益生菌產品以及行業制度的制約，目前市場上的水產用益生菌產品多是芽孢桿菌和乳酸菌，少數產品也有和酵母菌組合。當前應用于對蝦養殖中的益生菌制劑菌種單一，針對性不強，作用效果不穩定。一般來說，復劑比單一菌株的效果要好，而商業益生菌產品的復配多為缺乏依據的組合。此外有關益生菌和中草藥、免疫多糖及酶制劑的復配也值得關注。

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