飼料銅水平對(duì)方格星蟲稚蟲生長(zhǎng)的影響

許明珠，童 潼，張 琴，董蘭芳，蔣 艷，楊家林

( 廣西壯族自治區(qū)海洋研究所，廣西海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 北海 536000 )

方格星蟲(Sipunculusnudus)為北部灣特色經(jīng)濟(jì)海產(chǎn)品和近年來重點(diǎn)發(fā)展增養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)動(dòng)物之一,它生長(zhǎng)快、病害少、活動(dòng)范圍小，味道鮮美，營養(yǎng)豐富，養(yǎng)殖面積和市場(chǎng)需求量逐年增大[7]。因此，研究有效促進(jìn)方格星蟲生長(zhǎng)、適宜人工養(yǎng)殖的飼料，以提高方格星蟲產(chǎn)量來滿足日益增長(zhǎng)的市場(chǎng)需求十分重要。目前有關(guān)方格星蟲對(duì)飼料脂肪、蛋白、糖、硒、鐵和錳的需求已有研究[8-13]，而對(duì)飼料銅的研究卻鮮見報(bào)道。本試驗(yàn)測(cè)定了由同一批受精卵孵出、規(guī)格相同、體質(zhì)健康的方格星蟲稚蟲攝食含蛋氨酸銅飼料的質(zhì)量日增加、組織銅含量和消化酶活性，研究了微量元素銅對(duì)方格星蟲稚蟲生長(zhǎng)的影響，為研發(fā)規(guī)模化養(yǎng)殖方格星蟲人工配合飼料提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)飼料

蛋氨酸銅含銅量17%，由濰坊康科潤生物技術(shù)有限公司友情提供，于基礎(chǔ)飼料中分別添加蛋氨酸銅0、4、8、16、32 mg/kg和64 mg/kg(表1)，制成6種試驗(yàn)飼料。經(jīng)GB 13885—2003方法測(cè)定，飼料(以干物質(zhì)計(jì)算)中銅的實(shí)際含量分別為2.7、7.5、11.2、19.8、30.4 mg/kg和52.1mg/kg。飼料制作參照文獻(xiàn)[14]的方法進(jìn)行，制成150目微顆粒飼料，標(biāo)號(hào)裝袋備用。

表1 試驗(yàn)飼料基礎(chǔ)配方及營養(yǎng)成分分析(干物質(zhì))

注：1.每千克飼料維生素混合物提供：VD2400 IU，VE100 mg，VK1 mg，VC70 mg，VB10.5 mg，VB27 mg，VB66 mg，VB121 mg，D-泛酸32.6 mg，煙酸28 mg，生物素1 mg，葉酸7.5 mg，肌醇440 mg.2.每千克飼料礦物質(zhì)預(yù)混料提供：CaCO33000 mg，ZnSO4·7H2O 300 mg，CaH2PO44125 mg，MnSO4·H2O 270 mg，NaCl 1200 mg，Na2SeO3·H2O 0.75 mg，KCl 750 mg，MgSO4·7H2O 1525.5 mg，F(xiàn)eSO4·7H2O 750 mg，AlSO4·6H2O 6 mg，CoCl2·6H2O 45 mg，KI 6 mg，沸石粉3021.75 mg.

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼養(yǎng)管理

養(yǎng)殖試驗(yàn)于2013年8月至9月在廣西海洋研究所海水增養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)基地進(jìn)行。試驗(yàn)用稚蟲取自廣西海洋研究所培育的同批人工孵化苗種。正式試驗(yàn)前，先給試驗(yàn)稚蟲投喂基礎(chǔ)飼料14 d，使之逐漸適應(yīng)試驗(yàn)飼料和養(yǎng)殖環(huán)境。馴養(yǎng)結(jié)束后，隨機(jī)選出健康無病、活力較強(qiáng)、體質(zhì)量相近[(18.46±0.11) mg]的稚星蟲7200條，飼養(yǎng)于18個(gè)底層鋪有約10 cm細(xì)沙的65 cm×55 cm×45 cm水槽中，每個(gè)水槽放養(yǎng)400條稚星蟲。本試驗(yàn)采用自然光照，自然水溫(26～30 ℃)，二級(jí)過濾海水(鹽度 18～22)，24 h連續(xù)微充氧(溶解氧>5.0 mg/L)，日換水兩次(9:00和17:00)，換水后過量投喂，保證沙子表面有少量未食用完全的餌料。養(yǎng)殖過程中每日巡視兩次，及時(shí)清除和記錄死亡的個(gè)體。

1.3 樣品采集與指標(biāo)測(cè)定

養(yǎng)殖結(jié)束后，將停食吐沙2 d的各組方格星蟲收集，保存于-80 ℃超低溫冰箱中。

平均終末體質(zhì)量/mg=m/n

質(zhì)量日增加/mg·d-1=(mt-m0)/t

式中，m和n分別為試驗(yàn)結(jié)束時(shí)每個(gè)水族箱中稚蟲的總體質(zhì)量(mg)和總數(shù)量(條)，m0和mt分別為星稚蟲平均初始體質(zhì)量(mg)和平均終末體質(zhì)量(mg)，t為試驗(yàn)天數(shù)(d)。

飼料、蟲體、體壁(解剖剪剪開后去除內(nèi)臟和體腔液所得)均采用GB 13885—2003方法進(jìn)行測(cè)定。將樣品于550 ℃馬福爐中灰化，用濃鹽酸溶解殘?jiān)⑾♂尪ㄈ荩缓髮?dǎo)入原子吸收分光光度計(jì)(4510F，上海儀電分析)的空氣—乙炔火焰中，測(cè)定銅元素的吸光度，并與元素校正溶液的吸光度比較定量。體腔液中銅含量采用化學(xué)法測(cè)定，試驗(yàn)原理為：在pH=9的氨溶液中，銅離子與二乙基二硫代氨基甲酸鈉作用，生成摩爾比為1∶2的黃棕色膠體配合物，在452 nm處測(cè)定吸光值，標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量銅離子的含量。

消化酶的活性的測(cè)定方法：參照南京建成生物工程研究所試劑盒的組織勻漿方法，將稚星蟲整體勻漿進(jìn)行酶液制備。蛋白酶活性采用Folin-酚法；脂肪酶活性和淀粉酶活性采用南京建成生物工程研究所試劑盒測(cè)定。以牛血清蛋白作標(biāo)準(zhǔn)，用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定酶液蛋白含量。酶活力用比活力(U/mg)表示。

本試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0進(jìn)行方差分析，若差異達(dá)到顯著，則進(jìn)行Tukey′s多重比較，顯著性水平為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 方格星蟲攝食含不同銅水平飼料時(shí)的質(zhì)量日增加

不同銅水平顯著影響方格星蟲稚蟲的終末體質(zhì)量和質(zhì)量日增加(P<0.05)，銅含量為11.2 mg/kg時(shí)終末體質(zhì)量和質(zhì)量日增加最高(0.68±0.02)mg/d，顯著高于銅含量為2.7、19.8、30.4 mg/kg的試驗(yàn)組(P<0.05)，但與銅含量為7.5、52.1 mg/kg的試驗(yàn)組差異不顯著(P>0.05)(表2)。銅含量最低(2.7 mg/kg)的試驗(yàn)組稚蟲的質(zhì)量日增加顯著低于其余各組(P<0.05)。

2.2 方格星蟲攝食含不同銅水平飼料時(shí)組織的銅含量

飼料銅水平均顯著影響方格星蟲稚蟲體中體壁銅含量和蟲體銅含量(P<0.05)(表3)。稚星蟲的體壁銅含量和蟲體銅含量均隨著飼料中銅含量的提高而升高。當(dāng)飼料銅含量為52.1 mg/kg時(shí)，稚星蟲的體壁銅含量和蟲體銅含量均達(dá)到最大值，且其體壁銅含量顯著高于較低(2.7 mg/kg)銅含量組(P<0.05)；蟲體銅含量顯著高于2.7、7.5 mg/kg和11.2 mg/kg銅含量組。各處理組稚蟲體腔液銅含量為2.32～4.53 μg/g，組間差異不顯著(P>0.05)。

表2 方格星蟲攝食含不同銅水平的飼料時(shí)的質(zhì)量日增加(平均值土標(biāo)準(zhǔn)差)

注：同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)無字母或相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05).下同.

表3 飼料銅水平對(duì)方格星蟲稚星蟲組織銅的影響(平均值土標(biāo)準(zhǔn)差) μg/g

統(tǒng)計(jì)分析表明，體壁銅含量(y)與飼料銅含量(x)的回歸方程為(圖1)：

y=0.8431ln(x)+0.683(r2=0.9351)

體腔液銅含量y1與飼料銅含量x1(2.7、7.5、11.2、19.8 mg/kg)的線性回歸方程為(圖2)：

y1=0.1094x1+2.1031(r12=0.9138)

體腔液銅含量y2與飼料銅含量x2(19.8、30.4、52.1 mg/kg)的線性回歸方程為(圖2)：

y2=0.0118x2+3.935(r22=0.9371)

由圖2可知，當(dāng)飼料銅含量(x)小于18.69 mg/kg時(shí)，體腔液銅含量(y)符合y1方程式；當(dāng)飼料銅含量(x)大于18.69 mg/kg時(shí)，體腔液銅含量(y)符合y2方程式。

2.3 方格星蟲稚蟲攝食含不同銅水平飼料時(shí)消化酶的活性

飼料的銅水平對(duì)方格星蟲稚蟲的蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶活性均無顯著影響(P>0.05)(表4)。各處理組稚星蟲蛋白酶活性為0.58～0.67 U/mg，淀粉酶活性為0.45～0.58 U/mg，脂肪酶活性為0.45～0.47 U/mg。

圖1 方格星蟲稚蟲體壁銅含量與飼料銅含量的回歸分析

圖2 方格星蟲稚蟲體腔液銅含量與飼料銅含量的回歸分析

3 討 論

3.1 飼料銅水平對(duì)方格星蟲稚蟲質(zhì)量日增加的影響

已有研究表明，羅非魚(Oreochromis)和草魚(Ctenopharyngodonidellus)對(duì)飼料中谷氨酸銅[15]、斑節(jié)對(duì)蝦(Penaeusmonodon)對(duì)飼料中蛋氨酸銅[16]的生物利用度大于硫酸銅；凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)對(duì)飼料中各種銅源的生物利用度為蛋氨酸銅>富馬酸銅>硫酸銅>堿式氯化銅[17-18]；而異育銀鯽(Carassiusauratusgibelio)對(duì)飼料中各種銅源的生物利用度則為堿式氯化銅>氨基酸銅絡(luò)合物>硫酸銅[19]。

本試驗(yàn)中，在銅含量為11.2 mg/kg時(shí)，方格星蟲的質(zhì)量日增加最大，繼續(xù)增加飼料銅的含量，稚星蟲的質(zhì)量日增加下降，然后緩慢上升趨于平穩(wěn)。這與軍曹魚研究結(jié)果類似[23]。究其原因可能是方格星蟲沒有肝臟等器官，解毒能力較弱，銅元素和鋅元素在生物體內(nèi)具有拮抗作用，過度升高飼料中銅含量會(huì)影響生物對(duì)鋅元素的吸收，因此高含量的飼料銅可能在一定程度上抑制方格星蟲的生長(zhǎng)[24-26]。

3.2 飼料銅水平對(duì)方格星蟲稚蟲體成分組織銅含量的影響

在其他水產(chǎn)動(dòng)物的研究中，飼料中銅含量升高對(duì)凡納濱對(duì)蝦的肝胰臟中銅含量有顯著影響，但對(duì)肌肉中銅含量均無顯著影響；飼料銅水平為10、30、50 mg/kg時(shí)，硫酸銅和蛋氨酸銅為銅源極顯著影響凡納濱對(duì)蝦肝胰臟的銅含量[27-28]。葉超霞等[29]研究高銅水平飼料的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，高銅水平飼料組的斜帶石斑魚(Epinepheluscoioides)全魚和肝胰臟中的銅含量顯著高于銅適量組。本研究中，飼料銅含量對(duì)方格星蟲體壁銅含量和蟲體銅含量有顯著影響，對(duì)體腔液銅含量無顯著影響，與上述研究結(jié)果略有出入。一般水產(chǎn)動(dòng)物都將體內(nèi)大部分銅儲(chǔ)存于肌肉、骨骼和肝臟等器官組織中，方格星蟲屬于低等水生動(dòng)物，體內(nèi)并無骨骼和肝胰臟，其體內(nèi)銅主要儲(chǔ)存于體壁肌肉細(xì)胞和體腔液中，因此可能造成飼料銅含量的變化對(duì)體壁銅含量以及蟲體銅含量影響顯著[30]，但是各試驗(yàn)組體腔液中銅元素含量差異不顯著的原因還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

試驗(yàn)結(jié)果表明，飼料銅含量變化顯著影響方格星蟲的質(zhì)量日增加、體壁銅含量和蟲體銅含量(P<0.05)，但各組體腔液銅含量和消化酶活性差異不顯著(P>0.05)。綜合質(zhì)量日增加和飼料成本，建議方格星蟲稚蟲飼料銅水平為7.5～11.2 mg/kg。

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