葡萄糖和果糖對海捕野生大黃魚精子活力的影響

羅 芬,黃偉卿,2,李進壽,阮少江,林 婕,阮俊峰,周逢芳

( 1.寧德師范學院 生物系，福建 寧德 352100；2.寧德市鼎誠水產有限公司，福建 寧德 352100 )

大黃魚(Pseudosciaenacrocea)為我國特有的中下層暖溫性近海集群洄游魚類，主要分布于南海、東海和黃海南部，原為我國海洋四大主要捕撈對象之首[1-2]。經過30多年的養殖發展，至2015年全國大黃魚產量達1.48×105t，年產值約120多億元，成為我國最大規模的海水網箱養殖魚類和八大優勢出口養殖水產品之一[3]。大黃魚養殖快速發展的同時，累代近親繁殖導致生長性能、形態特征、抗逆性能降低等[4-6]。對大黃魚群體進行遺傳性狀改良和良種選育具有現實意義，而海捕野生大黃魚群體在遺傳特性、營養結構、形態特征、抗逆性能等方面均優于養殖大黃魚群體[7-10]。但海捕野生大黃魚成活率低，直接作為或培育至親本用于種質改良難度大，因此有效保存海捕野生大黃魚的精液對保護和改良大黃魚種質資源具有重要意義。

Gardiner[11]認為，魚類精子具有三羧酸循環代謝能力。嚴安生等[12]指出，單糖在精漿中的主要作用是維持精子運動。谷巍[13]發現，高白鮭(Coregonuspeled)精子在葡萄糖或果糖溶液中激活效果較好。迄今為止，有關糖類對大黃魚精子活力的影響研究較少，僅朱東發[14]報道過葡萄糖等環境因子對養殖大黃魚精子的激活率和活動時間的影響，張藝等[15]在稀釋液中添加0.005 mol/L葡萄糖保存精子；而在果糖中保存精子的研究未見報道。魚類精子活力是人工授精稀釋液的配制及精子低溫、超低溫保存的基礎。筆者研究了葡萄糖和果糖劑量對大黃魚精子活力的影響，旨在補充和豐富大黃魚生殖生物學資料，為人工繁殖時精子稀釋液和冷凍保存液的配制和大黃魚種質資源改良提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

選取健壯、外表無損傷及病害的體長26.5～35.4 cm、體質量325～520 g的成熟海捕野生大黃魚雄魚7尾，每尾注射劑量為5 μg/kg的促黃體素釋放激素類似物，暫養24 h后進行試驗。

1.2 方法

1.2.1 精液的采集與保存

用干毛巾擦拭魚體，吸干生殖孔周圍及體表的水分，用手輕擠壓腹部兩側擠出精液，用干凈的膠頭滴管從生殖孔吸取未受污染的精液，放小培養皿中并加蓋，置冰箱4 ℃保存，定期取少許待檢。經顯微鏡檢查精子活力在90%以上者用于試驗。

1.2.2 葡萄糖溶液和果糖溶液的配制

以砂濾海水配制濃度為0、100、200、300、400、500、600、700、800、900 mmol/L的葡萄糖溶液和果糖溶液。

1.2.3 精子活力的觀察

采用平板載玻片法。調好10×40倍的顯微鏡焦距，滴一滴試驗液于干燥潔凈的載玻片上，用消毒的解剖針蘸取少許精液均勻涂于試驗液中，精液與試驗液接觸的瞬間立即啟動秒表計時，觀察記錄精子活動情況[16]。以1個視野為準，每個樣品重復3～5次。

精子在水中的運動狀態分為激烈運動、緩慢運動和搖尾運動3個連續階段，這3個階段時間的總和為總運動時間，即精子的壽命。各階段的具體劃分標準參照文獻[17]。

1.2.4 數據處理

試驗數據以平均值±標準差表示，用SPSS 17.0軟件處理，用單因素方差分析法進行差異顯著性檢驗。

2 結 果

2.1 葡萄糖和果糖溶液劑量對海捕野生大黃魚精子活力的影響

葡萄糖濃度為0、100、900 mmol/L時，大黃魚精子不運動；200～800 mmol/L時，精子被激活；200～500 mmol/L時，激烈運動、平均壽命隨濃度升高而延長；500 mmol/L時激烈運動和平均壽命達最大值，分別為(172.11±7.60) s和(654.44±36.95) s；超過500 mmol/L則隨濃度升高逐漸縮短；500 mmol/L葡萄糖溶液對大黃魚精子激烈運動的影響顯著高于其他濃度(P<0.05)；500 mmol/L與600 mmol/L間的平均壽命差異不顯著(P>0.05)(表1)。

果糖濃度在0、100、800、900 mmol/L大黃魚時，精子不運動；200～700 mmol/L時，精子被激活并運動；200～600 mmol/L時，激烈運動和平均壽命隨濃度升高而延長；600 mmol/L時，激烈運動和平均壽命達最大值，分別為(160.78±8.80)s和(599.56±21.13) s；超過600 mmol/L時，隨濃度升高明顯縮短；600 mmol/L果糖溶液對大黃魚精子活力的影響顯著高于其他濃度(P<0.05)(表2)。

表1 葡萄糖溶液濃度對海捕野生大黃魚精子活力的影響 s

注：同列中帶不同上標字母的平均值間差異顯著(P<0.05)，下同.

表2 果糖溶液濃度對海捕野生大黃魚精子活力的影響 s

2.2 葡萄糖溶液和果糖溶液與海捕野生大黃魚精子激烈運動時間的關系

大黃魚精子在0～200 mmol/L葡萄糖溶液中無激烈運動，數學模型為y=0(0 mmol/L

果糖濃度在0～100 mmol/L和800～900 mmol/L時精子無激烈運動，數學模型y=0(0 mmol/L

葡萄糖和果糖溶液對大黃魚精子激烈運動影響的比較表明，最適葡萄糖溶液對激烈運動時間延長的效果明顯優于最適果糖溶液濃度(圖1)。

2.3 葡萄糖溶液和果糖溶液與海捕野生大黃魚精子壽命的關系

0～100 mmol/L葡萄糖溶液中精子不運動，擬合的精子壽命數學模型y=0(0 mmol/L

圖1 葡萄糖和果糖溶液對海捕野生大黃魚精子激烈運動時間的影響

0～100 mmol/L和800～900 mmol/L果糖溶液中精子不運動，數學模型為y=0(0 mmol/L

圖2 葡萄糖和果糖溶液對海捕野生大黃魚精子壽命的影響

試驗結果表明，果糖溶液在濃度較高時表現出較好的延長精子壽命的作用，而葡萄糖溶液在相對較低濃度時就表現出了較好的延長效果，且葡萄糖溶液對大黃魚精子壽命的影響普遍明顯高于果糖(圖2)。

3 討 論

精、卵質量與活力決定著人工繁育中的受精率，延長激烈運動時間可提高受精率，也是考察魚類人工繁育中精子質量的重要指標之一。體外受精魚類中，精子在精巢或精漿中沒有活力，只有排到水環境中才被激活，其活力受pH、溫度、鹽度、離子、糖類等因素影響[13]。如果精子在最適條件下被激活，將顯著提高受精率，有助人工繁育的順利進行，保證魚類胚胎的質量，對種質資源的改良亦具積極的促進意義。

魚類精子發生過程中形成的能量物質很少，體外精、卵相遇時精子入水耗費了大量能量以調節滲透壓平衡，可用于維持運動的能量甚少，因此精子被激活后運動時間十分短暫。有研究表明，適當濃度的糖類可提高鯉魚(Cyprinuscarpio)、團頭魴(Megalobramaamblycephala)、高白鮭、大鱗副泥鰍(Paramisgurnusdabryanus)、白斑狗魚(Esoxlucius)、大彈涂魚(Boleophthalmuspectinirostris)等魚類精子活力[12-13,18-20]。本試驗中，適當濃度的葡萄糖或果糖溶液可激活大黃魚精子，并延長激烈運動時間和壽命，即對大黃魚精子運動具明顯促進作用，與上述研究結果相似。其原因是葡萄糖、果糖、半乳糖等是魚類精漿的重要組成成分，參與精子代謝，維持精子活力[12]。Gardiner[11]認為，魚類的精子是具有三羧酸循環代謝的能力，通過氧化葡萄糖、果糖等外源性碳水化合物得到能量補償，尤其是葡萄糖、半乳糖和果糖這三種單糖是精子活動及存活可選擇的能源[21]。單糖物質有效地延長了精子活動時間，精卵有更多接觸機會，勢必大大提高人工授精的受精率。朱冬發[14]報道，葡萄糖溶液影響養殖大黃魚精子的活動時間，筆者關注不同濃度葡萄糖溶液對精子激烈運動和壽命的影響，因為延長激烈運動時間對受精過程中精卵的結合更具有實際意義。通過建模進一步求出最適葡萄糖濃度：527 mmol/L葡萄糖溶液中大黃魚精子激烈運動時間最長；559 mmol/L葡萄糖溶液中大黃魚精子壽命最長；超過該濃度精子活力逐漸下降，這可能與濃度升高導致了外界溶液滲透壓過高，在運動過程中需要消耗能量調節滲透壓有關。故建議人工授精時選擇527～559 mmol/L葡萄糖溶液作為激活的稀釋液，以提高大黃魚精子活力，保持激烈運動時間，延長壽命，提高受精率。0～100 mmol/L和大于900 mmol/L精子無運動，因此這兩個范圍的葡萄糖溶液可作為大黃魚精子保存液的參考值。

糖類作為外源營養物質對魚類精子活力的影響多見于葡萄糖[11-15,18-21]，果糖的研究較少。谷巍等[13]關注了果糖對高白鮭精子活力影響；萬全等[19]比較了葡萄糖、果糖等5種糖類對大鱗副泥鰍精子的保存效果，認為不同糖類保存精子的效果不同，保存效果由高到低依次是：葡萄糖>蔗糖>L-山梨糖>D-果糖>D-木糖。本試驗首次關注果糖溶液對大黃魚精子活力的影響，且通過數學建模求出最適果糖濃度為614 mmol/L，大黃魚精子的激烈運動時間最長；597 mmol/L果糖液大黃魚精子的壽命最長。由此建議人工授精時可選擇濃度為597～614 mmol/L的果糖溶液作為激活的稀釋液，以延長精子壽命，保持精子激烈運動時間，提高受精率。果糖濃度在0～100 mmol/L和800 mmol/L之后時，精子無運動能力，這兩個濃度可作為大黃魚精子保存液的參考值。

雖然果糖和葡萄糖都是單糖，但對海捕野生大黃魚精子活力的影響并不完全相同，這與兩種單糖溶液的理化性質緊密相關。最適葡萄糖溶液比最適果糖溶液對延長大黃魚精子激烈運動時間和精子壽命的效果更好，因此，葡萄糖較果糖更適宜作為海捕野生大黃魚精子的激活液。而大黃魚精子對這兩種單糖吸收和利用的具體機制有待進一步研究。

致謝

寧德市富發水產有限公司提供試驗魚，在此表示衷心感謝！

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