RAD測序技術及其在水生生物研究中的應用

胡景杰，任紅艷

( 國家自然科學基金委員會生命科學部，北京 100085 )

RAD測序技術是利用限制性內切酶消化降低基因組的復雜度，對特定的酶切片段進行高通量測序，實現基因分型的技術。RAD測序技術操作簡便，能夠不依賴參考基因組序列進行大規模SNP位點的開發，成為非模式生物尤其是水生生物最為有效、經濟的SNP 開發方法，RAD測序技術已經應用于群體進化、遺傳圖譜構建、QTL定位、性狀關聯和系統發生分析等研究領域，提供了解析重要的復雜性狀分子機制的有效途徑。與此同時，在RAD測序基礎上發展起來了多種新型的RAD測序技術為研究者提供了更多的選擇。筆者綜述了RAD測序技術的原理、幾種RAD測序技術的比較及RAD測序技術在水生生物研究中的應用。

1 RAD-seq技術的定義

RAD標記是緊鄰限制性內切酶酶切位點的一段短的DNA序列標簽[1]，廣泛分布于整個基因組。隨著二代測序技術的快速發展和成本的降低，RAD-seq技術成為更具活力和應用價值的簡化基因組測序方法[2-3]，RAD-seq技術在動植物的群體進化研究、遺傳圖譜構建和QTL定位以及全基因組關聯分析上均得到了廣泛的應用。RAD測序的流程主要為：(1)利用限制性內切酶對基因組進行酶切；(2)連接酶切片段與P1接頭，P1接頭序列包含有Illumina的通用引物結合位點和用于區分不同個體的barcode序列；(3)然后將帶有接頭的片段隨機打斷；(4)打斷后連接上另一端接頭P2；(5)對連接產物進行片段選擇；(6)片段選擇后的連接產物進行PCR擴增，富集得到兩端含有正確接頭的產物，最后進行高通量測序。RAD標簽構成了一個簡化的基因組，便于獲得酶切位點附近的序列信息，從而發現SNP；選擇的不同限制性內切酶，可以篩選出所需的足夠數量的SNP標記。RAD-seq優點不僅體現在低成本的測序，更主要的是可對基因組所有酶切位點進行測序和分型，并且雙末端測序平臺的應用能夠獲得SNP位點的側翼序列，為后續的研究帶來極大的便利。對于無參考基因組的物種，也可進行大規模的SNP位點篩查，具有較高的準確性，可在較短的時間內完成變異檢測及其他的生物學分析。RAD-seq技術廣泛應用在模式生物和非模式生物的遺傳分析，如三棘刺魚(Gasterosteusaculeatus)的群體分化和選擇的研究[4]，蚊子的系統進化研究[5]，虹鱒(Oncorhynchusmykiss)SNP標記開發[6]，大麥(Hordeumvulgare)高精度圖譜構建的研究[7]等。

隨著研究的深入，基于RAD-seq的改進技術也不斷涌現，包括2b-RAD[8]、ddRAD[9]、ezRAD[10]和Rapture[11]等，這些方法在文庫構建的難易程度、酶切標簽的基因組覆蓋度等方面存在一定差異。RAD-seq也為甲基化的檢測提供了思路，例如，EpiRAD[12]和MethylRAD[13]技術，為缺乏基因組信息的非模式生物的甲基化研究提供了新的高效的方法。

1.1 2b-RAD技術

2b-RAD技術是對等長RAD標簽進行測序分型的RAD技術[8]。IIB型限制性內切酶的能夠識別雙鏈DNA的6個特異堿基對，在識別位點的上下游將DNA酶切，產生出3′端帶有3個隨機堿基突出的33 bp標簽。通過黏性末端的匹配使標簽和接頭連接，再經PCR擴增富集目的片段后進行高通量測序。該方法的準確性和實用性在模式生物擬南芥(Arabidopsisthaliana)中得到驗證。由于等長標簽擴增效率的一致性，使2b-RAD技術的分型準確率較高；無需片段選擇，文庫構建簡便快捷，更為突出的特點是，2b-RAD技術可通過接頭添加選擇性堿基來調節獲得基因組標簽的密度，可以根據研究目的和需求開發SNP標記，易于控制成本。水生生物研究中往往進行樣本數目較多的遺傳分析，應用2b-RAD技術大規模開發SNP標記是一種低成本的快速有效的手段。Jiao等[14]利用2b-RAD技術對櫛孔扇貝(Chlamysfarreri)全同胞F1作圖家系進行了大規模SNP位點的開發，構建了高密度遺傳連鎖圖譜。目前該技術已經廣泛應用于馬氏珠母貝(Pinctadamartensii)[15]、仿刺參(Apostichopusjaponicus)[16]、中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)[17]等水產生物的SNP標記的開發、遺傳圖譜構建和全基因組選育等[18]。

1.2 ddRAD技術

Peterson等[9]在2012年發明了ddRAD-seq(雙酶切RAD測序)技術，以白足鼠(Peromyscus)為例，描述了其流程，并證實其方便實用。ddRAD-seq技術主要包括：(1)同時使用一種高頻酶和一種低頻酶酶切基因組DNA；(2)接頭與酶切片段連接，其中P1接頭和P2 接頭分別設計有不同的突出序列，能夠分別與兩種酶的黏性末端互補進行連接；(3)連接產物混合后進行片段選擇；(4)PCR擴增富集文庫，引入索引序列增加平行測序樣本通量。ddRAD技術與RAD-seq技術主要有兩方面的改進：無需隨機打斷和末端修復，采用兩種限制性內切酶同時處理基因組DNA，酶切標簽數目提升，且起始DNA用量降低；其次，采用更為精準的片段大小選擇方法，片段大小均勻性提高，進而個體間分型重復性和分型準確性均有提高。此外，ddRAD整個流程耗時8 h以內，比RAD-seq技術更為簡易和節省成本。ddRAD-seq技術可應用于各種生物學問題的解析，Kai等[19]利用ddRAD技術篩選日本鰻鱺(Anguillajaponica)SNP標記，將2672 個SNP標記整合到遺傳連鎖圖譜。目前該技術已經應用于貝類SNP標記開發和基因分型[20]、小丑魚(Amphiprionbicinctus)景觀遺傳學研究[21]等。

1.3 ezRAD技術

Toonen等[10]在2013年發表了ezRAD(限制性酶切RAD)技術，其主要包括：(1)使用內切酶(一種或幾種)消化基因組DNA至300～500 bp的片段范圍；(2)使用Illumina TruSeq試劑盒建庫并測序。由于使用商品化的試劑盒建庫，流程簡單快速，操作更為容易，但成本相對較高。其他RAD-seq技術通常需要通過選擇特殊的內切酶或者通過選擇不同的接頭調整RAD標簽的密度，但ezRAD對消化基因組的內切酶沒有特殊要求，只要能將DNA酶切到一定片段長度范圍即可。Toonen等[10]以珊瑚、軟體動物、海星和海豚等多種非模式生物作為研究對象，對ezRAD技術的實用性和靈活性進行了評價，結果表明，該技術對各門類物種都具有廣泛的適用性。

1.4 Rapture技術

Ali等[11]在2016年發表了Rapture(RAD捕捉)技術，其主要針對已知位點的標記開發，主要包括：RAD標簽的分離、文庫的測序及分析。該技術結合了RAD和捕獲測序的優勢，能夠以較低的成本快速高效的對大量個體的測序位點進行分析。使用的物理方法富集RAD標簽能夠消除PCR引入的擴增偏離效應，覆蓋更多的唯一比對位點，提高測序效率。Ali等[11]在虹鱒中證實了Rapture技術的可靠性，并分析了虹鱒的種群結構。該技術可廣泛應用于農業、環境和生物醫學等方面，提高遺傳分析的效率。

1.5 EpiRAD技術

在ddRAD技術基礎上，Schield等[12]發明了EpiRAD技術，該技術的將ddRAD技術中的一種酶替換為甲基化敏感性的內切酶HpaⅡ，通過對非甲基化位點的測序來檢測基因組甲基化狀態的變化。研究人員利用該技術檢測了在有無捕食者的不同試驗條件下，來源于同一克隆種群的水蚤(Daphniaambigua)世代間的基因組甲基化狀態。結果顯示，由于捕食者的存在，水蚤產生了表觀遺傳的變化，導致其生活史特征的改變。通過表觀遺傳分析探究了水蚤對魚類捕食的適應方式及表型變化的主要機制。另外，研究人員還指出EpiRAD方法不僅可以用于無性繁殖群體的變異檢測，對有性繁殖群體或者試驗群體的檢測同樣適用。

1.6 MethylRAD技術

MethylRAD技術[13]是在2b-RAD基礎上發展起來的一種適用于非模式生物的高效、低成本的全基因組DNA甲基化檢測技術，與2b-RAD技術具有相似的建庫流程，簡便易操作。其原理是利用甲基修飾依賴型內切酶對基因組進行酶切產生包含有甲基化位點的標簽，只對獲取的甲基化標簽進行測序，從而檢測基因組范圍內的甲基化位點。MethylRAD技術為非模式生物的甲基化研究提供了全新的技術方法和思路，可以通過表觀調控水平上的比較分析篩選與性狀調控相關的候選基因。Wang等[13]利用MethylRAD技術對“海大金貝”和普通蝦夷扇貝(Patinopectenyessoensis)進行了全甲基化組比較分析，篩查得到調控“海大金貝”閉殼肌類胡蘿卜素積累的重要候選基因LPCAT1。

2 幾種RAD技術的比較

任何一種RAD-seq技術都有其優點和不足，對5種RAD技術的比較見表1。RAD-seq、ddRAD以及ezRAD技術構建的文庫均具有較長的插入片段，使無參照基因組的RAD數據更易于de novo拼接，從而能夠獲得更多的基因組信息，方便位點的功能注釋和SNP側翼序列的引物設計。RAD-seq需要超聲打斷，超聲打斷具有片段長度選擇的偏好性，會影響測序位點的基因組代表性及位點間測序深度的均勻度[22]。RAD-seq技術文庫的構建流程過于繁瑣，周期長，需要配備超聲波DNA破碎儀等。Rapture技術使用物理方法富集RAD標簽能夠消除PCR引入的擴增偏離，覆蓋更多的獨立比對位點。2b-RAD、ddRAD和ezRAD技術建庫流程相對要簡單得多，ez-RAD技術可以利用Illumina TruSeq Kit試劑盒，易于操作，并且結合Illumina的無需PCR的樣品制備方法，能夠消除PCR擴增過程中的偏向性，但成本較高。2b-RAD和dd-RAD建庫流程簡便，可以通過多種方式(ddRAD通過選擇不同的內切酶和片段大小，2b-RAD通過接頭添加選擇性堿基)靈活控制獲得SNP數目，能夠以很低的成本獲得每個個體幾百個數目的SNP位點，特別適用于只需少量位點的大樣本的群體結構分析。2b-RAD可以對等長RAD標簽進行測序，無需片段選擇，所有酶切位點標簽均能擴增測序，等長標簽擴增時具有較好的一致性，因此標簽在文庫之間重現性強。值得一提的是，ddRAD技術采用了更精確的片段選擇手段——全自動核酸電泳和片段回收系統，一定程度上可以降低片段選擇過程對相同位點在文庫間代表性的影響，另外通過試驗初期的監測，可以評估樣品酶切片段的均勻度，排除轉座子等高頻出現的片段。ddRAD可有效的應用于基因組較大并且未測序的物種。此外，RAD和ezRAD技術對起始基因組DNA質量的要求相對更高，2b-RAD技術建庫不涉及打斷和長片段選擇的過程，DNA的降解對建庫和結果的影響小，建庫的起始量可低至1 ng[23-25]。

表1 5種RAD方法比較

3 RAD-seq數據生物信息分析

RAD-seq技術在圖譜構建、全基因組育種及遺傳進化等多個領域得到廣泛應用，由于海量的數據分析，與RAD-seq技術相關的生物信息分析和高通量數據處理迅速發展。目前，常用的RAD-seq的生物信息學軟件主要有Stacks[26]、RADtyping[27]、RADtools[28]和pyRAD[29]等。

Stacks是由俄勒岡大學 Julian Catchen 開發的適用于 RAD-seq序數據分析的軟件[26]。該軟件將最大似然法應用到無參考基因組的de novo SNP分型中，能消除測序錯誤對分型準確性的影響，可以處理各種類型的RAD-seq數據文件，適用于遺傳圖譜、群體基因組學及系統發生分析等研究。Stacks核心處理步驟主要包括5個模塊：(1)利用process_radtags程序按照barcode區分樣本序列并剔除掉測序質量不高的序列；(2)物種無參照基因組信息時，利用ustcaks聚類組成基因座位，有參考基因組信息時選擇Pstacks程序；(3)利用cstcaks將雙親的基因座位進行整合；(4)通過stacks程序將親本和子代的基因座位進行查找對應；(5)根據不同的研究方向，選擇population或者genotypes進行群體或者圖譜分析。

RADtyping是一套集成共顯性和顯性標記分型的流程化軟件包，尤其適用于無參照基因組的非模式生物2b-RAD數據分析。對顯性標記的分型有效提高了標記的利用率，能夠降低測序成本。該軟件提出了一種基于混合泊松/正態分布模型的de novo SNP分型新算法(iML)，能夠有效消除重復序列對分型的干擾，通過模擬數據和實際測序數據的分析結果顯示，iML的分型準確率明顯提高，假陽性率可降低20%[27]。RADtyping整合了共顯性和顯性標記de novo分型算法實現所需的所有perl腳本，不僅可以處理單端測序的RAD數據，還適用于其他類型的雙端測序的RAD數據。軟件實現無參考基因組SNP de novo分型的核心步驟有3步：(1)利用親本標簽序列混合聚類構建代表性參考序列；(2)根據改進的極大似然法(iML)去除由于測序錯誤造成的低覆蓋度的序列和重復序列造成的高覆蓋度的序列，構建高質量的參考序列，并將獲得的參考序列分為雙親共享和親本特異的兩種類型；(3)個體數據與兩種類型的參考序列進行比對，根據軟件算法進行共顯性和顯性標記的分型。

4 RAD技術在水生生物研究中的應用

4.1 水生生物遺傳圖譜的構建

水生生物的主要經濟性狀大都屬于數量性狀，其遺傳機制比較復雜，受到多基因控制，要精確定位進行輔助育種需要高密度的連鎖圖譜。伴隨著二代測序技術的快速發展和RAD-seq等簡化基因組測序技術的出現，一次試驗可篩查到數以千計的SNP標記，為高密度圖譜構建提供了充裕的標記數目。RAD-seq技術不依賴于物種的基因組信息，在水生生物大規模分子標記開發和高密度遺傳連鎖圖譜構建等研究領域得到了廣泛應用。已發表的利用RAD-seq技術構建遺傳圖譜的水生生物包括斑馬魚、海帶、海參、扇貝、虹鱒、尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)、日本囊對蝦(Marsupenaeusjaponicus)、比目魚等等[14, 16, 30-35]。Li等[36]利用RAD-seq技術篩選了1373個分離的SNP標記構建了馬氏珠母貝的遺傳連鎖圖譜，對 7個生長性狀進行了連鎖分析。Ao等[37]利用RAD-seq技術構建的大黃魚(Larimichthyscrocea)的圖譜包含了10150個標記，標記間的平均間距0.54 cM。由4994個SNP標記構建的海帶圖譜，為評價種質資源和重要經濟性狀的遺傳基礎解析提供了有力的工具[34]。綜上所述，利用RAD技術構建的水生生物圖譜的標記數目都是數以千計，大大地突破了以往利用傳統方法篩查標記所構建的圖譜密度，對推動水生生物的遺傳學研究具有重要的意義。

4.2 水生生物重要性狀的分析

4.3 水生生物的種群遺傳學研究

在種群遺傳研究中通常利用少數個體進行標記開發，選取多態性高的位點進行種群遺傳學分析，這些標記往往只反映該物種的一小部分多態性而難以準確推斷不同種群的遺傳距離和親緣關系。RAD-seq技術可使SNP開發和分型同時完成，避免了上述缺點，為缺乏參考基因組或有著復雜進化史的生物種群多樣性研究提供了有效手段。Hohenlohe等[4]通過RAD-seq技術研究了三棘刺魚不同群體的種群分化，選取來自2個阿拉斯加南部的海洋群體和 3 個淡水群體的100 個個體，鑒定了基因組范圍內45 789個SNP。評估了三棘刺魚群體的遺傳多樣性, 發現2個海洋群體盡管相隔較遠，但由于存在劇烈的基因流而無顯著遺傳分化。淡水群體和海水群體之間則表現出相對較大的遺傳分化，在6個連鎖群的9個區域有分化，這些區域覆蓋12.2 Mb，包括590個基因，其中31個與骨骼發育和滲透壓調節性狀相關，這些基因對淡水的適應起重要作用，初步揭示了淡水三棘刺魚適應性的平行進化機制。Larson等[44]對來自于阿拉斯加西部的5個大鱗大麻哈魚(O.tshawytscha)的群體結構及趨異適應性問題進行了研究。利用RAD技術開發了10 944個SNP位點，對個體溯源的效率顯著提高，同時還鑒定到733個位點和3個受選擇的基因組區域。

海洋中存在數目巨大的浮游動物，由于沒有天然的物理隔離屏障，有高頻的基因交換，地理群體分化的研究一直是一個難題。RAD技術能夠獲得幾百上千的SNP位點，能發現群體中存在的微小的遺傳變異，高密度的SNP標記使群體分化系數和群體結構等參數的計算更為準確，為海洋生態群落結構的研究提供一種新的技術手段和方法。Blancobercial等[45]利用2b-RAD技術分析了北大西洋的海洋橈足類(Centropagestypicus)的群體結構，其結果與已知的形態學特征分析的結果一致。同時還研究了西北太平洋大陸架生態海域的群體遺傳結構，比較了幾種不同遷移方向的群體，結果表明應用2b-RAD技術進行海洋浮游動物群體結構的研究分析要顯著優于其他技術方法。

4.4 水生生物的全基因組選擇育種

全基因組選擇是利用基因組范圍內的遺傳標記對生產性狀進行育種值估算，從而達到標記輔助選擇育種的目的。全基因組選擇的前提是要有高密度的遺傳標記。高通量低成本的簡化基因組的SNP分型技術為水生生物的遺傳育種研究提供了契機。Dou等[18]以蝦夷扇貝(Patinopectenyessoensis)為材料，分析了2b-RAD技術在全基因選擇育種中的應用潛力。模擬分析表明盡管該技術只獲得基因組部分標記信息，但能夠準確的估計出個體的育種值。值得一提的是2b-RAD技術具有標簽密度易于調節的優勢，為研究人員在分型成本和育種準確率之間提供了更多選擇。同時對5個家系的349個蝦夷扇貝進行2b-RAD標記分型(2364個高質量SNPs標記)，通過5倍交叉驗證表明育種值的估計準確率約為0.4。這些分析表明2b-RAD技術可以為水生生物分子育種研究提供理想的標記分型平臺。

4.5 水生生物的種間系統發生學研究

隨著基因組時代的到來，研究人員可以通過基因組序列探討物種間的進化關系。但是對于經濟價值不高、基因組過大的物種來說，全基因組測序的方法并不合適。研究表明，RAD技術能夠提供更多的基因組變異信息，是研究系統發生的有力工具[46]。山鳉(Orestias)是安第斯高原特有魚類，形態特征聚類分析表明的的喀喀湖的山鳉魚分為4個組，RAD-seq數據的分子系統學研究表明其中3個為共同起源[47]。Takahashi等[48]利用RAD數據，重建了東非洲麗魚科的系統樹，RAD數據構建的系統樹與以前的研究結果有所不同，但RAD數據構建的系統樹的自展值更高，結果更加可靠。RAD-seq技術可以不依賴基因組信息，就實現全基因組水平上的系統發生分析，侯睿[49]利用2b-RAD技術分析了扇貝科10個物種的系統發生關系，基于種間共享的2b-RAD標簽構建的系統樹與已知的根據形態分類的結果很相近。

4.6 水生生物的比較基因組學分析研究

比較基因組是通過不同物種基因組水平的比較，揭示基因組進化特征和機制，包括基因組保守性、重排和復制等。遺傳連鎖圖譜是水生生物等非模式生物進行比較基因組研究的有力工具，利用RAD技術構建高密度圖譜，能夠提供更為全面的基因組結構信息。Braasch等[50]利用RAD-seq技術構建了斑雀鱔(Lepisosteusoculatus)的遺傳圖譜，利用圖譜上將近1000個編碼區的RAD標記對硬骨魚、斑雀鱔和人的染色體進行了比較基因組學分析，證實了斑雀鱔與硬骨魚的分化要先于硬骨魚的基因組加倍，并且與硬骨魚相比，斑雀鱔與人類基因組結構更為相似。Kakioka等[51]將鯉科屬(Gnathopogon)2個近緣種雜交獲得F2群體，利用RAD-seq技術，構建了包含有1622個標記的連鎖圖譜，平均圖距為0.97 cM。根據獲得的RAD標簽序列，與斑馬魚、三棘刺魚、青鳉魚和河鲀進行了比較基因組學分析。結果表明該魚有13個連鎖群和斑馬魚染色體是共線性的，而其他的連鎖群和斑馬魚染色體之間存在著重排。Lien等[52]以來源于142個家系的3297條大西洋鮭(Salmosalar)為材料，利用RAD技術構建了包含5650個SNPs的遺傳圖譜，并與三棘刺魚進行了比較基因組分析，通過同源區域和變異區域，推測大西洋鮭具有特殊的性別特異性重組。

5 小 結

隨著測序成本降低和測序能力的提高，不久的將來對每個研究對象個體進行全基因組測序將成為可能，但對于大多研究而言，全基因組測序往往得到過多的數據，造成信息量過剩，使分析復雜化，產生浪費。RAD測序技術由于具有的簡便性、有效性、低成本等優勢，水生生物無論基因組大小，是否具有參考基因組序列，均可應用RAD測序技術大規模開發SNP標記，實現精確的基因分型，開展遺傳解析。因此，RAD測序技術在水生生物高密度遺傳圖譜的構建、QTL精細定位以及群體遺傳和進化等領域具有廣泛的應用前景。通過RAD測序技術獲得的豐富的遺傳標記信息能夠有效地對水生生物群體的遺傳多樣性和系統發育進行分析，揭示群體的遺傳結構，為水生生物育種和遺傳改良提供基礎性資料，對于優良性狀的培育、種質資源研究等具有重要的意義。

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