對植物油中縮水甘油酯的兩種氣相色譜質譜測定方法的比較分析

(北京市東城區疾病預防控制中心， 北京 100050)

縮水甘油酯(glycidol fatty acid esters，GEs)是一種縮水甘油和游離脂肪酸的酯化產物，是一種新型的油脂危害物[1]。2009年，德國聯邦風險評估所(BfR)提出，GEs 本身不具有致癌性，但在人體中會代謝為縮水甘油，縮水甘油是一種具有基因致癌性的化合物，國際癌癥研究所(IARC)將它定為2A級致癌物[2，3]。且縮水甘油在鹽酸的存在下易轉換成氯丙醇，而氯丙醇，特別是其中的3-氯-1,2-丙二醇酯(3-MCPD)是一種公認的潛在致癌物。3-MCPD是食品添加劑聯合委員會(JECFA)指出的一種具有腎臟、生殖、遺傳和神經毒性的致癌物，建議其最高允許攝取量(PMTDI)為2 μg/kg[4]。2016年，歐盟(EFSA)對3-MCPD、2-MCPD和縮水甘油脂肪酸酯與人類健康進行了風險評估，評估表明絕大多數植物油/脂肪中含有氯丙醇酯及縮水甘油酯，制定了3-MCPD(包括酯)的TDI值為0.8μg/kg[5]。

由于對精煉植物油中氯丙醇酯及縮水甘油酯的含量及其健康的危害的關注，大量對氯丙醇酯及縮水甘油酯的檢測方法開始涌現。其中主要分為直接法和間接法兩類。直接法是指不破壞氯丙醇酯及縮水甘油酯的結構，直接對其進行測定的方法。這類方法主要應用液相色譜-質譜(LC-MS)進行測定[1,6]。直接法優點是可以單獨對各類縮水甘油酯進行測定，可以通過測定了解其種類和數量，并對后續產生機制、毒理學等研究奠定基礎；缺點是其標準品種類繁多，且有很多種標準品沒有商業化，造成標準品難得且花費很昂貴。間接法是指選取易于與甘油酯發生特異性反應的物質進行衍生化處理，通過測定其含量間接測定縮水甘油酯含量的方法。這類方法主要使用氣相色譜質譜(GC-MS)進行測定，目前應用比較廣泛，德國脂肪科學學會(DGF)等標準操作方法均使用了間接法[7,8]。間接法的優點是可以直接測定縮水甘油酯的總量，成本比較低；缺點是無法測定單一的縮水甘油脂肪酸酯的含量，且需要轉化，在操作過程中可能出現偏差。

間接法測定縮水甘油酯的方法也有兩種，一種是將縮水甘油酯轉化為氯丙醇，通過測定前后氯丙醇含量的變化、換算為縮水甘油酯含量的方法；另一種是將縮水甘油酯轉化為溴丙醇，通過測定溴丙醇對縮水甘油酯進行計算的方法[8,9]。本文對這兩種方法的操作及檢測結果、方法學參數進行比較。

1 材料與方法

1.1 儀器

GCMS-QP2010Ultra氣相色譜質譜儀(日本島津公司)；氮吹儀(美國Organomation公司)；電子天平(日本A&D公司)；電熱恒溫鼓風干燥箱(英國CARBOLITE公司)；馬弗爐(英國CARBOLITE公司)；渦旋混勻器(德國IKA公司)。

1.2 試劑

甲基叔丁醚、四氫呋喃、無水乙醚、乙酸乙酯、甲醇、正己烷均為色譜純；苯基硼酸(PBA)，含量不得低于97%；無水硫酸鈉：450℃烘烤2h以上后使用；實驗用水為GB/T 6682規定的一級水；其他試劑未指明均為分析純。

1.3 標準物質

氯丙醇棕櫚酸二酯標準品(3-MCPD)，氯丙醇硬脂酸二酯標準品(2-MCPD)，縮水甘油棕櫚酸酯(GLY)，氘代棕櫚酸二酯(d5-3-MCPD)、氘代硬脂酸二酯(d5-2-MCPD)，氘代縮水甘油棕櫚酸酯，≥98%(加拿大TRC公司)。使用前換算為以游離態氯丙醇及縮水甘油計，并分別稀釋成10μg/mL的混合標準及 2μg/mL的混合內標溶液。

1.4 兩種檢測方法 [8,9]

兩種用于測定GEs的分析方法流程圖見圖1。

圖1 兩種用于測定GEs的分析方法流程圖

1.5 儀器工作參數

色譜柱：DB-5ms毛細管色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；載氣: 氦氣，純度≥99.999%，流速1mL/min；進樣口溫度: 250℃；程序升溫：初溫60℃,保持1 min,以6℃/min升至150℃，再以10℃/min升至300℃保持5min；進樣量: 1μL；電離方式：EI源, 70eV；離子源溫度：250℃；進樣方式：無分流進樣；溶劑延遲時間：6min；掃描方式：選擇離子掃描(SIM)；定量離子及定性離子見表1。

表1 MCPD、MBPD及其內標的衍生物的監測離子m/z

2 結果與分析

2.1 方法步驟比較

兩種方法均采用了將氯丙醇酯及縮水甘油酯轉化為醇的間接測定方式，方法A(氯代法)通過酯交換在含Cl離子的條件下將縮水甘油酯轉化為氯丙醇酯，通過測定氯丙醇酯在含Cl離子及不含Cl離子的條件下轉化含量的變化，檢測結束后通過3-MCPD含量乘以固定系數的方法計算GEs；方法B(溴代法)則是先通過將縮水甘油酯溴代轉化為溴丙醇酯(MBPD)，再通過水解測定溴丙醇酯的含量計算出GEs的含量。

兩種方法從測定原理上來說，方法A進行了假設，即縮水甘油酯是形成氯丙醇酯的唯一前體，需要乘以一個經驗系數，這個系數對不同的樣品的符合程度并不相同；方法B則是可以直接進行GEs的計算，無需使用經驗系數。通過B法，可以直接同時測定GEs和MCPD，A法則不可以(如圖2所示)。從這個角度來說，方法B是可以更加準確測定GEs的方法。

從實際操作過程中，方法A所需要的樣品量較大，且水解時需要嚴格控制時間，對操作人員的要求較高，但耗時較短(約2h)；由于MBPD在強堿環境下很不穩定，無法使用耗時短的強堿水解的條件，方法B耗時很長(約26h)。故在實際操作過程方面方法A有速度快的特點。

圖2 兩種方法的樣品測定SIM圖

根據以上比較，A法適用于有熟練操作人員的樣品快速測定，B法適用于對大量樣品的一次性準確測定。

2.2 方法學參數的比較

2.2.1 方法線性范圍和檢出限

分別對兩種方法的線性范圍和檢出限進行測定，兩種方法的檢出限(LOD)、定量限(LOQ)和線性方程如表2所示。方法A只測定3-MCPD，方法B測定的是3-MBPD，在(0～1000)ng范圍內，兩種方法的測定組分都能有良好的線性關系。兩種方法的定量限相近，均可以滿足實際樣品測定的要求。

表2 方法線性方程及方法檢出限

2.2.2 方法精密度和準確度

對植物油樣品進行三水平加標，分別進行6次平行實驗，計算待測物質含量的相對標準偏差及回收率，其結果見表3。由表3可知，兩種方法回收率范圍在58.5%～102.9%，相對標準偏差小于等于10%，兩種方法均能滿足GEs的測定要求。

表3 樣品加標回收率及精密度(n=6)

2.3 樣品測定值的比較

2.3.1 對質控樣品測定結果的比較

對FAPAS質控樣品T2649QC樣品進行6次平行實驗，計算GEs含量。如表4所示，兩種方法對于GEs的測定的精密度和準確度均滿足測定要求，在實際中可以正常使用。同時，兩種方法比較中發現，方法A的結果普遍比方法B的測定結果高；且計算中發現，對同一樣品的測定中RSD偏大，考慮由于是差減法進行計算其結果造成的。

2.3.2 對實際樣品測定結果的比較

對一件花生油樣品進行10次平行實驗，計算GEs含量，并對兩種方法測定的GEs含量進行t檢驗。結果發現，方法A測定的樣品檢測結果比方法B的測定結果高，且用兩種方法測定的GEs含量P<0.05(如表4所示)，有統計學差異，在實際樣品測定應用中不能混用，需要指定方法。

表4 樣品測定結果

3 結論

本實驗對兩種間接測定GEs的方法的操作及檢測結果、方法學參數及測定樣品的結果進行了比較。通過比較發現，兩種方法在操作上各有優勢，線性范圍相當，準確度及精密度均符合GEs測定的要求，均可以在實際測定中使用。但兩種方法中，溴代法的測定精密度相對較好、檢測含量偏低；氯代法的測定精密度相對較差、檢測含量偏高，兩種方法在檢測結果上有統計學差異，在實際樣品測定中需要對方法進行明確。故氯代法適用于有熟練實驗操作人員、需要快速進行測定的樣品；溴代法則適用于大量樣品GEs的一次性測定。兩種方法可以在實際樣品測定中，按規定分情況使用，以滿足不同類型的檢測需求。