微探頭超聲破碎輔助提取-HPLC-ICP/MS快速測定海產品中甲基汞

(淮安市疾病預防控制中心，淮安 223001)

1 引 言

無機汞(Hg2+)和甲基汞(CH3Hg+)是生物樣品中最為常見和豐富的兩種汞形態[1]。汞在環境中的毒性，生物特性和轉運取決于其化學形態[2]。眾所周知，有機汞毒性遠大于無機汞。無機汞在水生生物體內甲基化形成甲基汞并在海洋生物中通過食物鏈進行富集[3]，汞的生物蓄積性最密切的幾個因素是魚類的大小和/或脂肪含量[4,5]，蛋白親和機制[6]以及魚類棲息地中溶解氧的含量[7]。

從復雜基質樣品中提取形態汞是其測定前的最關鍵步驟。汞形態分析需要較高的提取效率，更重要的是需要在分析前保持原始價態的完整性[8]。汞對巰基有較高的親和力，使得L-半胱氨酸和2-巰基乙醇成為超聲提取形態汞的兩種常用試劑。蒸餾法、酸和堿提取法等多種提取方法在樣品制備過程中容易使無機汞轉化為甲基汞[9,10]，為了避免這種情況發生，常用的方法是在中等溫度和pH下從生物組織中提取形態汞[11]。一些研究表明，汞提取效率隨著2-巰基乙醇濃度的增加而增加[8]。

超聲輔助提取現在是一種非常有前途的汞形態前處理提取技術。已有學者通過這種提取方式并采用HCl溶液從魚肉組織中獲得較高的提取效率[12]。另外，酶通過作用于特定化學鍵可以避免汞化學形式改變[13]，酶水解已用于樣品中形態汞的提取[10]。采用超聲波探頭可以有效減少萃取時間，目前該技術已成功應用于多種基質中形態硒的酶水解提取[14]。

本研究在現有研究方法的基礎上對比分析酸浸提和酶水解分別在超聲輔助下對海產品中甲基汞提取效率的影響，并對超聲振幅、超聲時間、萃取劑用量和樣品量等前處理參數進行細化比較，篩選出簡單快速、準確可靠，適用于海鮮產品中甲基汞定量提取的前處理方法。

2 材料與方法

2.1 儀器與試劑

XⅡ型電感耦合等離子體質譜儀(美國熱電公司)；1260型高效液相色譜儀(配自動進樣器，美國安捷倫公司)；Eclipse Plus C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm，美國安捷倫公司)；超純水儀(德國密理博公司)；超聲波細胞粉碎機(上海辛苪儀器設備有限公司)；DELTA 320型pH計(美國梅特勒-托利多公司)；H-1850R型高速離心機(湖南湘儀離心機儀器有限公司)；塑料瓶和玻璃器皿在10%HNO3中浸泡24小時，去離子水漂洗5次，干燥后使用。

2-巰基乙醇(分析純，美國Merck公司)；L-半胱氨酸(日本東京化成工業株式會社)，蛋白酶XIV和脂肪酶(上海如吉生物科技發展有限公司)。Tris-HCl緩沖液(0.05mol/L)(北京索萊寶科技有限公司)；氧化汞(光譜純，德國Merck公司)；甲基汞標準品(德國Dr.Ehrenstorfer公司)；金槍魚中甲基汞標準物質(CRM-463)(歐盟標準委員會)；硝酸、鹽酸(優級純，美國Merck公司)。

2.2 方法

2.2.1 樣品前處理

準確稱取50 mg樣品至5 mL聚丙烯試管，分別加入2 mL酸浸提溶液和酶水解溶液進行提取，將樣品置于超聲波細胞粉碎機中以40%振幅超聲提取。超聲完成后7600 r/min離心15 min，0.22 μm濾膜過濾后上機。樣品提取一式三份，并以相同的方式制備空白樣。

2.2.2 儀器條件

以時間分辨分析模式進行定量，HPLC-ICP-MS詳細儀器參數見表1。

表1 HPLC-ICP-MS系統的參數

3 結果與討論

3.1 提取效率評估

研究中比較了幾種基于超聲波探針超聲提取的操作程序，分別采用酸浸提和有無汞絡合劑(L-半胱氨酸和2-巰基乙醇)酶水解提取方法。酸浸提法考察了不同濃度HCl溶液提取效果，并對超聲時間和超聲振幅強度等條件進行了考察。酶水解方法通過固定超聲參數考察蛋白酶并添加不同比例脂肪酶及其與不同濃度緩沖溶液配伍對甲基汞萃取效率的影響，同時觀察添加不同比例汞絡合劑(L-半胱氨酸和2-巰基乙醇)對酶水解提取效率的影響。

3.1.1 酸水解條件優化

酸水解法是汞提取最常用的方法之一[13]。采用鹽酸釋放與蛋白結合的甲基汞比硝酸或乙酸更有效[15]。

通常酸浸提法的提取效率基本上由酸濃度，超聲時間和超聲振幅決定。本研究在超聲振幅為40%和60%的條件下，分別在5 min和10 min內考察1、3、5和7 mol/L 4種濃度鹽酸溶液對金槍魚中甲基汞標準物質的提取效率，提取方法按照2.2.1中操作步驟進行。提取液中甲基汞含量采用2.2.2中HPLC-ICP-MS方法進行檢測，結果顯示標準物質中甲基汞回收率隨著HCl濃度的增加而增加，采用7 mol/L鹽酸回收率最高可達99±3%(圖1)?？赡茉蚴怯捎贖Cl在濃度低于7 mol/L時，金槍魚組織顆粒中仍存在汞殘留。研究顯示較短的超聲時間能獲得更好的提取效果，與5 min相比，超聲處理10 min回收率則顯著下降，可能原因是在超聲處理過程中汞被氧化而揮發損失。所以本方法選擇5 min作為最佳超聲時間。同時實驗中發現甲基汞提取效率隨著超聲振幅由40%增加至60%而降低，原因是高幅震動會使提取溶液產生大量空泡，從而影響超聲能量傳導。超聲波探頭的優點是可以處理微量樣品，本研究中采用不同濃度HCl溶液分別對5 mg和50 mg標準參考物質進行提取，圖2結果顯示5 mg回收率沒有明顯低于50 mg，可能原因是5 mg樣品量太小導致均質性不足。因此，本研究中選擇50 mg樣品作為最終質量參數，采用7 mol/L鹽酸溶液以40%振幅超聲提取5 min。

圖1 不同超聲時間對各濃度HCl提取液回收率的影響

圖2 各濃度HCl提取液對不同質量樣品的提取效率

3.1.2 酶提取條件優化

使用HCl作為萃取溶劑的ICP-MS定量汞形態分析方法存在以下幾個缺點：信號衰減、吸入溶液粘度的變化以及霧化效率和氣溶膠運輸的改變[16]。此外，高濃度的HCl溶液會影響超聲變幅桿的性能。本研究除了探討HCl的提取效果外，針對不同酶混合物的酶提取方式進行了評價。實驗中取50 mg金槍魚中甲基汞標準物質按照2.2.1操作步驟采用不同酶水解提取方式(表2)進行提取，提取完成后將不同酶提取液上機檢測，HPLC-ICP-MS儀器參數按2.2.2設置。表2顯示不同酶類在超聲輔助下的提取效率。其中僅采用蛋白酶XIV進行水解提取的回收率均未超過40%，為了提高萃取效率，實驗中額外添加了其他酶類，并使用pH等于7.5的緩沖液提高酶活性以及使用汞絡合劑等方法進行改進。從結果看添加脂肪酶反而降低了回收率，且與添加量無關。在水溶液中添加0.25%(w/v)的L-半胱氨酸以及在pH7.5的緩沖溶液中添加0.5%的L-半胱氨酸進行提取的回收率在40%左右。從結果看，2-巰基乙醇對提取效率有明顯的提升，回收率隨2-巰基乙醇的濃度增加而提高。當萃取溶液含有2.5%(v / v)的2-巰基乙醇和0.75%(w / v)的蛋白酶XIV時提取效率最高。其他研究報道中同樣觀察到采用2-巰基乙醇替代L-半胱氨酸進行汞提取，回收率獲得顯著提高[17]。另外，實驗中通過增加2-巰基乙醇百分比(5%(v / v))，以及對固體殘余物進行二次水解，都沒有獲得提取效率的明顯改善。因此，本實驗中選擇2.5%(v / v)2-巰基乙醇和0.75%(w / v)蛋白酶XIV的水溶液作為海產品中甲基汞的酶水解提取溶液。

表2 不同酶水解對金槍魚標準物質中甲基汞的提取效率

3.2 HPLC-ICP-MS分析汞的形態

很多報道指出超聲會導致價態的轉化[18]，所以本研究采用LC-ICP-MS分析了2-巰基乙醇進行酶水解得到的提取物。根據以前的研究方法[19]，選取C18色譜柱，0.1%w / v的L-半胱氨酸+ 0.1%w / v的L-半胱氨酸HCl H2O為流動相。向流動相添加0.1%(w/v)L-半胱氨酸可以防止色譜柱中汞的殘留和ICP-MS[20]中色譜峰中出現長拖尾。從圖3所示的甲基汞和無機汞標準品的洗脫圖中可以看出(使用表1中給出的分離條件)，兩種汞的分離只需要大約4 min。

圖3 無機汞和甲基汞標準色譜圖(10 μg/L)

3.3 方法學驗證

配制系列濃度的標準溶液并分別進行測定，在1～20 μg/L濃度范圍內甲基汞的相關系數(r)為0.996，具有很好的線性相關性。在方法規定的取樣質量條件下，按本方法測定標準參考物質，根據色譜響應值S/N≥3標準計算檢出限，甲基汞的檢出限為0.1 μg/kg。研究中按實驗方法對標準參考物質進行提取、凈化和檢測，測定回收率；1天內重復測定6次，計算日內精密度；3天內重復測定6次，計算日間精密度，本方法甲基汞的日內精密度為2.7～7.5%，日間精密度小于14%。這表明該方法的回收率和精密度較好，能滿足汞形態分析的要求。

3.4 市售海鮮樣品中汞的形態

對于所提出的方法的應用，在當地超市購買了不同類型的海鮮樣品(基圍蝦，章魚，魷魚，羅非魚，金槍魚，三文魚)，并通過提出的方法進行分析。結果見表3。根據GB2762—2012食品中污染物限量規定本次所測水產品的甲基汞含量均低于國家標準[21]。但由于甲基汞的生物鏈富集作用，位于食物鏈頂端的海產品中具有較高的含量，在日常飲食中應謹慎食用。

表3 本市市售的部分水產品甲基汞含量

4 結論

本研究分別采用酸浸提和酶水解提取兩種方法并結合使用超聲波探頭實現海鮮樣品中汞的定量提取。雖然本研究中酸浸提回收率(99±3%)高于酶水解提取(91±4%)，但由于酸浸提方法除本文中所述缺點外，提取液中和后的鹽分容易影響色譜柱柱效，所以實際工作中選擇酶水解提取方法作為甲基汞提取方法。本研究中采用微探頭超聲波破碎的輔助提取方式使得樣品制備程序更加簡單快速，在5 min內可以實現甲基汞的定量提取。方法檢出限低，線性范圍寬，適用于小樣本的提取制備，回收率和精密度均滿足日常檢測要求。該方法已成功應用于本地市場海鮮樣品中的甲基汞形態分析，為食品中甲基汞的檢測提供參考。