水熱法合成氮、鈷雙摻雜的熒光碳點及其性能研究

(1. 福建醫科大學藥學院藥物分析系， 福州 350004；2. 福建省產品質量檢驗研究院國家加工食品質量監督檢驗中心， 福州 350002)

傳統的量子點(Quantum dots，QDs)，由于其極小的粒徑而產生尺寸效應和量子限域效應，被激發以后能發射熒光，因此被廣泛應用于分析檢測、光學成像方面。但是傳統的半導體量子點如CdSe/ZnS型量子點，由于含有重金屬元素而具有一定的毒性，可能會對細胞與環境產生危害，從而限制了它的應用。碳點(carbon dots，CDs)是以碳元素為前體，比以往的量子點更安全，對生物分子的干擾小，有望代替傳統的量子點而被應用到光學成像[1]、生物醫學[2]及分析檢測[3]領域。

2004年Xu[4]等在制備單壁碳納米管過程中，首次發現了一種具有熒光性能的碳納米顆粒。2006年Sun[5]等首次采用激光刻蝕法制備粒徑為5 nm左右的碳點，該法可通過調節激光器脈沖能量和時間來調控碳點的大小，但需要昂貴的實驗儀器且量子產率較低，不利于大規模生產[6]。2008年Zhao等[7]在水溶液中用電化學氧化石墨棒的方法制備熒光碳點。2009年Zhu等[8]用微波法合成熒光碳點，該方法簡便、經濟。2010年Zhang等[9]以L-抗壞血酸為碳源利用水和乙醇的混合液為溶劑，在密閉的反應釜中加熱一定時間來制備碳點，由于設備簡單且條件可控，從而實現碳點熒光發射的調控。

近年來，科學家們希望找到制備較為簡便，造價更為低廉的方法來制備性能優異的碳點，并將其成功應用于醫學、光電學、生命科學[10-12]等領域。最近研究表明[13]碳點的粒徑與表面特征對其性質有至關重要的影響。小粒徑的碳點比表面積大，表面發光位點也較多。因此小粒徑的碳點發光強于大粒徑的碳點，進一步表明碳點發光是與表面相關的。另外，表面含有大量含氧基團如(羥基、羧基等)的碳點具有良好的水溶性且易于實現進一步功能化，良好的水溶性是納米材料表現出低毒性[14]的首要條件。本實驗以能同時提供C、N、Co元素的VB12為合成前驅體，采用一步水熱法制備水溶性熒光碳點，通過紫外-可見吸收光譜(UV-vis)、傅里葉變換紅外光譜(FT-IR)、X射線光電子能譜(XPS)表征可知所制備的碳點表面含有大量羧基。最后，實驗采用肝癌細胞(Hep G2)通過Cell counting kit 8(簡稱CCK-8)實驗法測定碳點的細胞毒性。

2 實驗部分

2.1 試劑與儀器

維生素B12：sigma公司；2-氨基吡啶：上海國藥集團化學試劑有限公司；RPMI-1640培養液：海克龍Hyclone公司；PB緩沖液：0.2 mol/L Na2HPO4-NaH2PO4，用NaOH溶液和H3PO4調至不同的pH緩沖液；PBS緩沖液：分別稱取KH2PO40.27 g，Na2HPO41.42 g，NaCl 8 g，KCl 0.2 g，加蒸餾水約800 mL ，用濃鹽酸調pH至7.4后定容到1 L。3-(4，5-二甲基噻唑-2) 2, 5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)溶液：0.0075 g MTT，用1.5 mL DMSO溶解；透析袋，上海綠鳥有限公司。上述試劑如無特別說明，均為分析純。

YZ-HR-25ML反應釜，北京巖征生物科技有限公司；UV-2450型紫外可見分光光度計，日本島津公司；F-4600型熒光分光光度計，日本日立公司；Nicolet 380 紅外光譜儀，美國賽默飛世爾科技；Tecnai G2 F20場發射透射電子顯微鏡，美國 FEI 公司；LabRAM HR800激光共聚焦拉曼光譜儀，法國Horiba Jobin Yvon公司；Thermo ESCALAB 250XI 電子能譜儀，美國賽默飛世爾科技；BS110S電子分析天平，美國Sartorius 公司；Neofuge 23R臺式高速冷凍離心機，上海力新儀器有限公司；pHS-3E型精密酸度計，上海雷磁儀器廠；Multiskan Mk3全自動酶標儀，美國賽默飛世爾科技。

2.2 熒光碳點的制備

首先精密稱取0.1355 g VB12，緩慢加入50 mL去離子水，配制成2 mmol/L的紅色透明溶液，存放在50 mL玻璃瓶中，4 ℃冷凍避光保存。移取10 mL上述溶液于25 mL聚四氟乙烯反應釜內襯中，于烘箱中反應并控制一定的水熱溫度與時間進行合成碳點。反應結束后，待溶液自然冷卻至室溫，用2 mol/L的氫氧化鈉溶液調pH至11.0后于25 ℃ 12000 r條件下離心10 min除去大顆粒物質，經0.22 μm微孔濾膜過濾，濾液在轉速10000 r/min下的超濾管(截留分子量為3 kd)超濾30 min。取超濾管下層分子量< 3kd的液體得到顆粒較為澄清溶液即為氮、鈷雙摻雜的碳點固體。

2.3 熒光量子產率的測定

熒光量子產率(fluorescent quantum yield)的測定是以2-氨基吡啶為參比物質，通過測量碳點和2-氨基吡啶的稀溶液在碳點最佳激發波長下所得的積分熒光強度和該激發波長下的吸光度值(吸光度值應小于0.1)。其計算公式為：

ΦX=ΦST*(GradX/GradST)*(ηX2/ηST2)

其中，ФX為待測物質的熒光量子產率，ФST為已知參比物質的熒光量子產率；GradX和GradST分別表示待測物質和參比物質的積分熒光強度與吸光度作圖工作曲線的斜率；ηX和ηST分別表示待測物質和參比物質的折光系數，0.1 mol/L 2-氨基吡啶的熒光量子率為60%，0.1 mol/L 硫酸水溶液和碳點水溶液的折光系數相同，均為 1.33。

2.4 碳點的細胞毒性研究

碳點具有較好的生物相容性和低細胞毒性，細胞毒性用Hep G2細胞通過CCK-8分析測定。CCK-8試劑中含有WST-8(2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽)，它可被細胞線粒體中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲臜產物。用全自動酶標儀在490 nm波長處測定其吸光度，可間接反映活細胞數量，從而作為碳點細胞毒性判斷依據。

3 結果與討論

3.1 水熱溫度的影響

水熱法是在密封的壓力容器中，提供一個在常壓下無法達到的特殊物理化學環境，使前驅體在反應系統中生成核結晶[15]。提高反應溫度或延長反應時間均可以促進VB12的碳化[16]。

首先對水熱反應溫度進行考擦，實驗中發現較低溫度(160和180℃)下合成的碳點溶液放置在 305 nm紫外燈下觀察，所發出的熒光十分微弱。當溫度升高至200～250℃后，熒光強度明顯增大?？梢娝疅釡囟葘μ键c的合成起著至關重要的作用，且高溫有利于碳點的快速生成。圖1為VB12溶液在200～250℃條件下水熱4 h制備得到碳點溶液的熒光光譜圖。其中插圖為碳點溶液在紫外燈照射下的圖片。由圖看出，碳點發藍色熒光，當溫度由180℃升到 250℃時，其熒光強度不斷增強，發射波長無明顯變化。這可能是因為在較高的反應溫度下制備的碳點其表面的氧化程度越高，帶了更多的缺陷發光位點。通過計算不同溫度(180～250℃)、4 h條件下合成碳點的熒光量子產率，在高溫250℃下熒光量子產率達8.16%(見表1)。

圖1 不同合成溫度下碳點的熒光光譜

3.2 水熱時間的影響

實驗還對水熱時間對碳點熒光的影響進行了考察，選擇了一系列水熱反應時間(見表1)。表1為不同條件下制備的碳點熒光量子產率。隨著反應時間的增加，熒光強度呈現明顯上升的趨勢。由表1可知，隨著反應溫度的升高和反應時間的延長，熒光量子產率逐漸增大。值得注意的是，當溫度升高至250℃后，反應1 h的熒光量子產率大于200℃與220℃下反應4 h的熒光量子產率。此外在240℃、6 h 條件下所合成的碳點，其熒光量子產率為7.56%，仍然小于250℃、4 h條件下合成的碳點?？梢娚邷囟忍键c的熒光量子產率的提高明顯比延長反應時間來得有效，可以在較短時間內得到熒光效率更高的碳點，縮短反應周期，提高反應效率。

表1 不同條件合成碳點的熒光量子產率

3.3 碳點的紫外-可見吸收光譜和熒光光譜

圖2A為250℃下反應4 h合成碳點的紫外吸收光譜，從圖中可以看到碳點溶液在275 nm處有吸收峰，這是由于碳點結構中C=C發生了π→π*躍遷所產生的。圖2B為碳點熒光光譜，隨著激發波長的不斷增大，碳點的熒光強度先增大后減小，發射波長隨激發波長的改變并未發生明顯變化，最大激發波長為275 nm。圖2C為碳點最佳激發波長和最佳發射波長對比圖，由圖可知碳點溶液的最佳激發波長和最佳發射波長為275 nm和380 nm，激發波長與發射波長之間存在很大的斯托克位移(105 nm)，可有效避免激發峰與發射峰的重疊，減小干擾，有利于碳點作為熒光納米探針用于分析檢測。

3.4 碳點的形貌表征

碳點水溶液呈墨綠色透明狀，且長期靜置后無明顯沉淀，可知所制備的碳點具有良好的水溶性。圖3A為碳點的高分辨透射電鏡圖，由圖可知，碳點呈規則的單分散球形，平均粒徑為3.26 nm，可均勻分散在水溶液中。晶格間距為0.26 nm，查文獻[15]可知與石墨的(100)晶面層間距一致(圖3B)。

圖2 碳點的紫外-可見吸收光譜和熒光光譜A.碳點溶液的紫外-可見吸收光譜；B.碳點溶液的熒光光譜；C.碳點溶液的最佳激發發射波長

圖3 碳點的高分辨透射電鏡(A)和粒徑分布圖(B)

3.5 碳點的紅外表征

圖4為碳點的紅外表征圖，由圖可知，碳點在1726 cm-1處有吸收，說明有C=O的存在；在3153 cm-1處的吸收峰對應-OH的伸縮振動峰，該峰強而鈍表明碳點表面的羥基間有氫鍵生成；1398 cm-1為C=N的伸縮振動峰；1629 cm-1為N-H的吸收峰；需要說明的是，結合1726 cm-1處的C=O峰及3153 cm-1處較寬的-OH吸收峰，說明碳點表面存在-COOH；綜上所述，可知碳點表面含有-OH、C=O、-COOH和C=N等官能團。C=N來自前驅體維生素B12中與金屬離子Co2+螯合的C=N鍵，我們可推測C=N→Co2+螯合鍵部分未遭到破壞，由此初步猜測在水熱反應過程后，所制備的CDs中的Co2+仍以螯合物形式存在。

圖4 碳點的紅外光譜圖

3.6 碳點的X-射線光電子能譜

實驗采用X射線光電子能譜(XPS)對C-dots所含元素進行分析。圖5為碳點的X-射線光電子能譜，對圖5A中的O1S峰C1S峰N1S峰分別進行分峰擬合得到O1S(圖5B)、C1S(圖5C)、N1S(圖5D)和Co(圖5E)的高分辨圖譜。由于Na元素所致的強背景峰，使微弱的Co元素峰在總XPS圖中幾乎不可見。圖5A中的284.8 eV、397.9 eV、531.1 eV、778.6 eV分別代表C 1s、N 1s、O 1s、Co4d的結合能，由圖譜可知碳點表面含有大量的C、O和N元素，Co含量極少，這也許同前驅體VB12的元素組成(C63H88CoN14O14P)有關。

3.7 pH對碳點熒光強度的影響

實驗考察pH(2.0～12.0)對碳點溶液熒光強度的影響。結果表明合成碳點在pH 2.0～5.0條件下熒光強度較高，碳點溶液的pH為1～2，碳點表面含有羧基短鏈，在酸性條件下碳點基本處于單分散狀態，熒光強度最大且穩定。然后在pH 6.0之后，碳點熒光強度隨著pH的增大而不斷減小，這可能是由于碳點表面的羧基解離程度改變，影響了碳點的熒光強度。

3.8 CCK-8細胞毒性檢測

首先用RPM1-1640培養液將氮氣下保存的肝癌細胞(Hep G2)復蘇增殖并傳代，得到一定數量的細胞。用胰酶將其從培養基上消化下來，用RPM1-1640培養液配成一定濃度的細胞懸液。將肝癌細胞轉移至96孔板，于37℃、5%CO2條件下培養24 h后，棄去上清液并用PBS緩沖液清洗細胞，再在不同孔內分別加入200 μL的12.5、25、50、100和

圖5 碳點的X-射線光電子能譜A.碳點的 XPS譜圖;B.O1S XPS譜;C.C1S XPS譜;D.N1S XPS譜;E.Co4d XPS譜

200 μg/mL 的培養液配制的碳點溶液，每個濃度設置5個平行孔。對照組加入200 μL的培養液，并設置6個空白孔，繼續培養24 h。取出上述制備的培養板，棄除上清液并用PBS清洗后，往各孔中加入20 μL PBS緩沖液配制的MTT溶液和180 μL無血清的培養基，再次在37℃、5%CO2下培養4 h。最后用酶聯免疫檢測儀測定各孔在490 nm波長處的吸光度，記錄并計算細胞存活率(ηviab)。計算公式：

ηviab=(Dsample-Dblank)/(Dcontrol-Dblank)×100%

式中：D為吸光度，下標為sample的表示孔中加有碳點溶液。下標為control的表示孔中未加碳點溶液，下標為blank的表示孔中沒有加肝癌細胞。

如圖6所示，隨著碳點溶液濃度的增大，細胞存活率并未呈下降趨勢，甚至濃度達到200 μg/mL時，也沒有產生明顯的細胞生長抑制作用。從結果觀察到肝癌細胞在含有濃度為12.5 ～ 200 μg/mL碳點的培養基中的活度與空白對照組相當，說明該碳點對肝癌細胞不但沒有毒性，還有微小的生長刺激性，可能是由于該碳點良好的水溶性與碳材料的化學惰性，使其具有極低的細胞毒性，且合成碳點中的Co2+以螯合物的形式存在，并不會對細胞產生生物毒性。

圖6 不同濃度CDs的細胞存活率

4 結論

本研究以VB12為合成前驅體，采用一步水熱法制備氮、鈷雙摻雜的熒光碳點，優化水熱反應時間和溫度對碳點熒光性能的影響，實驗發現250℃下反應4 h合成的碳點熒光量子產率最高，可達8.16%，在紫外燈下碳點溶液呈現明亮的藍色熒光。合成碳點顆粒平均粒徑為3.26 nm，表面含有大量羧基，具有良好的水溶性和穩定性。實驗考察pH對碳點熒光強度的影響，結果表明該碳點在pH2.0-5.0范圍內熒光最強。最后實驗還進行了碳點的CCK-8細胞毒性檢測，結果表明該碳點具有極低的細胞毒性和良好生物相容性。以上所有結果表明，通過本實驗合成的氮、鈷摻雜碳點有望作為熒光納米探針應用于生物醫學等領域。