超高效液相色譜-串聯質譜法檢測牛奶中雙氯芬酸鈉殘留

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(1. 北京市獸藥監察所，北京 102600； 2. 首都師范大學化學系，北京 100048)

雙氯芬酸鈉又名雙氯滅痛，其化學結構式如圖1所示，是常用非甾體類抗炎鎮痛藥[1，2]，通過抑制環氧化酶活性減少前列腺素的合成，同時可間接抑制白三烯的合成而發揮解熱、鎮痛及抗炎的作用[3]，在獸醫臨床上主要作為中小動物的解熱鎮痛藥，用于發熱、肌肉痛、關節痛和風濕痛等[4]。人體長期服用雙氯芬酸鈉口服制劑可造成胃腸刺激、神經性頭痛及電解質紊亂等不良反應[5]。歐盟規定雙氯芬酸鈉在牛和豬可食性組織中的殘留標識物為雙氯芬酸，在牛奶中最大殘留限量(MRL)為0.1 μg/kg[6]，我國尚未批準該制劑用于獸醫臨床[7]。

圖1 雙氯芬酸鈉化學結構式

目前，雙氯芬酸鈉檢測方法主要有液相色譜法[8]、氣相色譜法[9]、液相色譜-串聯質譜法[10，11]、高效液相色譜-串聯質譜法[12-14]及毛細管電泳法等。液相色譜法抗干擾能力差且靈敏度不能滿足檢測要求；氣相色譜法樣品衍生化前處理繁瑣且會帶來副反應。高效液相色譜-串聯質譜法由于無需對樣品進行衍生化處理，且分析時間短，靈敏度高，重現性好，將是未來雙氯芬酸鈉殘留檢測的發展方向。

本實驗建立了牛奶中雙氯芬酸鈉殘留測定的超高效液相色譜-串聯質譜方法，具有快速、準確、靈敏度高的優點。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

1.1.1 儀器

超高效液相色譜-串聯質譜儀(美國Waters公司)；電子分析天平(北京賽多利斯有限公司)；高速冷凍離心機(日本HITACHI 公司)；氮吹儀(Organomation Associates 公司)；溶劑過濾器(美國PALL公司)；旋渦混合儀(德國IKA公司)等。

1.1.2 試劑

雙氯芬酸鈉標準品及其同位素標記物均購自德國Dr公司，純度≥98.0%；乙腈、甲醇，色譜純，甲酸，質譜級，均購自美國Thermo Fisher Scientific公司；乙酸乙酯、正己烷、氯化鈉，分析純，均購自北京化工試劑廠。其他試劑均為分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 牛奶樣品前處理

取供試樣品10 g±0.5 g于50 mL離心管中，加入100 μL雙氯芬酸鈉13C同位素標記物標準工作液，高速渦旋1 min，靜置10 min；加入10 mL乙腈及1 g乙酸銨，高速渦旋2 min，4℃下4500 r/min離心20 min。取上清液轉入15 mL帶蓋聚丙烯離心管中，加入乙腈飽和過的正己烷3 mL，渦旋混勻1 min，4℃下4500 r/min離心10 min，棄去上層正己烷和下層水相；乙腈提取液于50℃下濃縮至干，加入1 mL流動相，渦旋振蕩并水浴超聲，使殘渣完全溶解，樣品過0.22 μm濾膜過濾，供超高效液相色譜-串聯質譜分析。

1.2.2 液相色譜參考條件

液相色譜條件：C18柱(50 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流動相：乙腈-0.1%甲酸水(55+45)；流速：0.3 mL/min；進樣量：5 μL；柱溫：室溫。

1.2.3 質譜參考條件

離子源：電噴霧(ESI)離子源；檢測方式：多反應監測(MRM)；掃描方式：正離子掃描；電離電壓：3.0 kV；源溫：150℃；霧化溫度：450℃；錐孔氣流速：150 L/h；霧化氣流速：800 L/h。

1.2.4 標準曲線繪制

精密稱取適量雙氯芬酸鈉標品，用乙腈溶解配制成質量濃度為1 mg/mL貯備液，再用乙腈稀釋配制5個不同濃度的標準工作液(0.05、0.1、0.5、3.0、5.0 ng/mL)，以雙氯芬酸鈉特征離子質量色譜峰面積對雙氯芬酸鈉13C同位素標記物(內標)特征離子質量色譜峰面積的比值為縱坐標，空白試料加標后被測物的質量濃度為橫坐標，繪制標準曲線。

2 結果與分析

2.1 色譜條件優化

采用C18反相色譜柱可使雙氯芬酸鈉較好分離，本研究結果表明柱長50 mm，柱內徑2.1 mm, 粒度1.7 μm，C18反相色譜柱對雙氯芬酸鈉分離效果最好。以乙腈-0.1%甲酸水(55+45)作為流動相，進樣量5 μL，流速0.3 mL/min。結果表明乙腈-0.1%甲酸水做流動相對雙氯芬酸鈉有良好的色譜分離效果，可兼顧質譜響應，色譜峰峰形較優。

2.2 質譜條件優化

根據雙氯芬酸鈉含有羧基的特點，可在酸性條件下用正離子模式檢測，一級全掃描質譜得到準分子離子峰([M+H]+)為296，可以看出雙氯芬酸鈉在酸性溶液中掉了個[Na+]，加了個[H+],調節毛細管電壓，錐孔電壓，使其豐度最大，進行二級質譜分析，選擇離子中豐度最大的兩個離子作為定量和定性離子，對各參數進行優化，質譜參數條件如表1。

表1 雙氯芬酸鈉及其同位素標記物定性定量離子對、錐孔電壓和碰撞能量

2.3 方法學考察

2.3.1 線性范圍

在最佳色譜條件下，配制標準工作液濃度0.05、0.1、0.5、3.0、5.0 ng/mL，雙氯芬酸鈉標準曲線見圖2。

圖2 雙氯芬酸鈉標準曲線

結果表明，在0.05～5 ng/mL濃度范圍內雙氯芬酸鈉色譜峰面積與濃度呈良好線性相關，回歸方程：y= 0.9654x+0.0214；相關系數R2為0.9996。

2.3.2 檢測方法靈敏度

方法檢測限(LOD)和定量限(LOQ)：按照藥物選擇離子響應色譜峰信噪比S/N>3(按PtP算)確定檢測限；按照藥物選擇離子響應色譜峰的信噪比S/N>10(按PtP算)確定定量限。

添加適量標準溶液于10 g空白牛奶中，分別制備得到0.02 μg/kg和0.05 μg/kg的添加樣品，按檢測步驟處理樣品、檢測。結果表明，牛奶中雙氯芬酸鈉檢測限(LOD)為0.02 μg/kg，定量限(LOQ)為0.05 μg/kg。

2.3.3 準確度和精密度

選取空白樣品進行空白添加實驗，驗證該方法的準確度和精密度，標準溶液、加標牛奶和實際牛奶樣品中雙氯芬酸鈉MRM色譜圖見圖3～圖5。添加濃度為0.05、0.1、2.0 μg/kg，每個濃度設5個平行，連續做3天，計算添加回收率、日內變異系數和日間變異系數。在三個濃度添加水平下，平均回收率為97.6%～113.0%，日內變異系數0.5%～9.5%，日間變異系數1.8 %～7.4 %。方法回收率高，精密度好，檢測方法準確度及精密度結果見表2。

表2 牛奶中雙氯芬酸鈉添加回收率和變異系數(n=5)

圖3 雙氯酚酸鈉標準品(MRM)色譜圖(2.0 ng/mL)

圖4 雙氯芬酸鈉牛奶添加MRM色譜圖(0.2 μg/kg)

圖5 牛奶中雙氯芬酸鈉MRM色譜圖

3 結論

本研究采用超高效液相色譜-串聯質譜技術建立了牛奶中雙氯芬酸鈉殘留的快速檢測方法，對液相色譜、質譜條件等進行了優化，并進行了方法學考察。結果表明，該方法快速、簡便，靈敏度高，重現性好，回收率高且穩定；適用于雙氯芬酸鈉定性定量分析。