超高效液相色譜-串聯質譜法檢測豬肌肉組織中烯丙孕素殘留

*

(1 .北京市獸藥監察所，北京 102600；2.首都師范大學化學系，北京 100048)

烯丙孕素是一種人工合成的甾類促孕激素[1，2]，化學結構式見圖1。烯丙孕素可抑制促性腺激素的釋放[3]，降低其在血漿中的濃度發揮藥理活性，畜牧業中常用烯丙孕素使動物同步發情進行繁育[4-6]。長期食用含有烯丙孕素藥物的肉制品會影響機體內激素平衡，誘發癌變，導致幼兒發育異常等[7]。目前很多國家已對食物中烯丙孕素殘留限量做出嚴格的規定和要求[8]，如日本規定鰻魚中烯丙孕素的最高殘留限量為3.0μg/kg，歐盟嚴格限制乙酰孕激素在動物生長中的使用。我國尚未批準該藥用于獸醫臨床。

圖1 烯丙孕素化學結構式

國外報道有關烯丙孕素殘留的檢測方法主要有酶聯免疫法[9]、液相色譜法[10]、氣相色譜-串聯質譜法[11]、液相色譜-串聯質譜法[12-14]等。酶聯免疫法具有較高靈敏度，但易出現假陽性；液相色譜法抗干擾能力差且靈敏度低，易受基質中結構相似化合物的干擾；氣相色譜法樣品衍生化前處理繁瑣等。國內關于烯丙孕素殘留檢測的報道很少，超高效液相色譜-串聯質譜法具有快速，靈敏度高，重現性好等優點，將是未來烯丙孕素殘留檢測的發展方向。

本實驗建立了豬肌肉組織中烯丙孕素殘留檢測的超高效液相色譜-串聯質譜方法，該方法快速、準確、靈敏度高，滿足國內外法規中關于烯丙孕素殘留定性定量分析。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

1.1.1儀器

超高效液相色譜-串聯質譜儀(美國Waters公司)；電子分析天平(北京賽多利斯有限公司)；高速冷凍離心機(日本HITACHI 公司)；氮吹儀(Organomation Associates 公司)；旋渦混合儀(德國IKA公司)。

1.1.2試劑

烯丙孕素標準品購自德國Dr公司，純度≥99.0%；乙腈、甲醇，色譜純，甲酸，質譜級，均購自美國Thermo Fisher Scientific公司；乙酸乙酯，分析純，購自北京化工試劑廠。其他試劑均為分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1樣品前處理

取豬肌肉組織樣本2g±0.01g于50mL離心管中，12000r/min高速勻漿2min，加入5mL乙腈+乙酸乙酯(V/V,3∶2)提取液，渦旋混勻5min，離心10min(4℃，10000r/min)，5mL提取液重復提取1次，將兩次提取上清液合并于15mL離心管中，置于-20℃冰箱，冷凍30min，快速轉移至預冷的離心機，離心5min(4℃，10000r/min)，棄去脂肪層，轉移溶液至15mL離心管，40℃水浴氮吹至干，殘余物用1mL20%乙腈水溶液復溶，上清液過0.22μm濾膜，供超高效液相色譜-串聯質譜儀測定。

1.2.2液相色譜參考條件

液相色譜條件：C18柱(50mm×2.1mm，1.7μm)；流動相A：乙腈，流動相B：0.1%甲酸水；流速：0.3mL/min，梯度洗脫參數見表1；進樣量：5μL；柱溫：室溫。

表1 烯丙孕素超高效液相色譜梯度洗脫條件

1.2.3 質譜參考條件

離子源：電噴霧(ESI)離子源；檢測方式：多反應監測(MRM)；掃描方式：正離子掃描；電離電壓：3.0 kV；源溫：150℃；霧化溫度：450℃；錐孔氣流速：150 L/h；霧化氣流速：800 L/h。質譜參考條件見表2。

表2 烯丙孕素定性定量離子對、錐孔電壓和碰撞能量

1.2.4 基質匹配標準曲線的制備

準確稱取適量烯丙孕素標準品，用甲醇溶解配制成質量濃度為1 mg/mL的標準儲備液，在空白基質中添加適量的標準工作液配制成5個不同濃度(1、5、10、25、50 ng/mL)，以濃度為橫坐標，對應的峰面積為縱坐標繪制標準曲線。

2 結果與分析

2.1 提取條件優化

烯丙孕素常用提取試劑有甲醇、乙腈、乙酸乙酯等有機溶劑。考慮到提取過程中雜質干擾和回收率測定，本實驗選用乙酸乙酯和乙腈作為提取液提取效果較優。

樣品中雜質主要為蛋白質、脂類及極性小分子成分，蛋白質和極性小分子可通過有機試劑去除[15]。脂類對檢測響應有較大干擾作用，常用去脂方法有加入正己烷萃取或采用冷凍脫脂，采用正己烷脫脂會導致提取液乙腈層的部分損失, 從而影響結果準確性。相關研究指出[16]，采用低溫冷凍方法去除脂類其效果可滿足檢測要求。

2.2 色譜條件優化

采用C18反相色譜柱可使烯丙孕素藥物較好分離，本研究結果表明柱長50 mm，柱內徑2.1 mm, 粒度1.7 μm，C18反相色譜柱對烯丙孕素分離效果最好。以乙腈-0.1%甲酸水作為流動相梯度洗脫，進樣量5 μL，流速0.3 mL/min。結果表明乙腈-0.1%甲酸水做流動相對烯丙孕素有良好的色譜分離效果，可兼顧質譜響應，色譜峰峰形較優。

2.3 質譜條件優化

不同藥物對流動相、流速、色譜柱等的響應和靈敏度不同，甚至會出現離子抑制或者增強效應，需考慮所測藥物化學結構，以達到滿意的效果。在正離子檢測方式下，選取豐度較強、干擾較小的兩對子離子為定性離子，對各參數進行優化，烯丙孕素標準品(MRM)色譜圖如圖2。

圖2 烯丙孕素標準品(MRM)色譜圖(4.0 ng/mL)

2.4 方法學考察

2.4.1 線性范圍

在選擇色譜條件下，添加適量標準工作液配制濃度1、5、10、25、50 ng/mL基質匹配溶液，烯丙孕素在豬肌肉基質中標準曲線見圖3。

結果表明，在1～50 ng/mL濃度范圍內烯丙孕素色譜峰面積與濃度呈良好線性相關，回歸方程：Y= 29146X+47967，相關系數R2為0.9969。

圖3 烯丙孕素在豬肌肉基質中標準曲線

2.4.2 檢測方法靈敏度

方法檢測限(LOD)和定量限(LOQ)：按照藥物選擇離子響應色譜峰信噪比S/N>3(按PtP算)確定檢測限；按照藥物選擇離子響應色譜峰的信噪比S/N>10(按PtP算)確定定量限。

添加適量標準溶液于2 g空白試樣中，分別制備得到0.3 μg/kg和1.0 μg/kg的添加樣品，按檢測步驟處理樣品、檢測。結果表明，烯丙孕素檢測限(LOD)為0.3 μg/kg，定量限(LOQ)為1.0 μg/kg。

2.4.3 檢測方法準確度和精密度

選取空白樣品進行空白添加實驗，驗證該方法的準確度和精密度，豬肌肉組織添加和空白中烯丙孕素MRM色譜圖見圖4和圖5。添加濃度為1.0、2.0、10.0 μg/kg，每個濃度設5個平行，連續做3天，計算添加回收率、日內變異系數和日間變異系數。在3個濃度添加水平下，平均回收率范圍為68.5%～87.9%；日內變異系數1.1%～6.0%，日間變異系數5.5 %～10.7%，方法回收率及精密度滿足殘留檢測要求，檢測方法準確度及精密度結果見表3。

表3 豬肌肉組織中烯丙孕素添加回收率和變異系數(n=5)

圖4 空白豬肌肉組織烯丙孕素MRM色譜圖

圖5 烯丙孕素豬肌肉組織添加MRM色譜圖(2.0 μg/kg)

3 結論

本研究采用超高效液相色譜-串聯質譜技術建立了豬肌肉組織中烯丙孕素殘留的快速檢測方法，對提取試劑、液相色譜、質譜條件等進行了優化，并進行了方法學考察。結果表明，該方法快速、簡便，靈敏度高，重現性好，回收率滿足殘留檢測要求；適用豬肌肉組織中烯丙孕素殘留檢測的要求。