微小RNA在女性生殖中的研究進(jìn)展

叢 晶，王 順，張多加，彭 艷，張?zhí)鞁龋蛭木辏瑓切Э?/p>

(1.黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150036；2. 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040； 3. 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001)

微小RNA(microRNA, miRNA)是長度為22～25個核苷酸的非編碼單鏈小RNA，通過與靶mRNA的3’-非翻譯端結(jié)合在轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，其主要作用是降解靶mRNA或抑制其翻譯[1]。miRNA作為轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)子在細(xì)胞增殖、分化、、凋亡及腫瘤發(fā)生等生物學(xué)過程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。在女性生殖方面，miRNA也逐步作為重要的分子生物標(biāo)志物用于評估卵巢功能胎盤功能、子宮內(nèi)膜容受性、妊娠檢測、胚胎發(fā)育以及妊娠并發(fā)癥[2]。

1 miRNAs在卵巢中的作用

miRNA是卵巢中表達(dá)最豐富的小RNA，參與卵泡發(fā)育的全過程，包括卵泡的生長、閉鎖和排卵。在卵泡發(fā)育的不同階段，miRNAs發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。在不同物種的卵巢、卵泡、卵丘細(xì)胞、卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體以及黃體中均研究了miRNAs的表達(dá)情況[3]。

1.1 miRNAs在顆粒細(xì)胞的作用

miR-143存在于小鼠初級卵泡、次級卵泡和竇卵泡的顆粒細(xì)胞中。通過轉(zhuǎn)染miR-143抑制劑發(fā)現(xiàn)，miR-143沉默能顯著增加雌激素的產(chǎn)生和類固醇合成相關(guān)基因的表達(dá)。體內(nèi)和體外研究均表明促卵泡激素( follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH)能夠明顯降低miR-143的表達(dá)，證實miR-143在FSH介導(dǎo)的雌激素合成以及顆粒細(xì)胞增殖中發(fā)揮重要作用[4]。

卵母細(xì)胞周圍顆粒細(xì)胞的凋亡是引起卵泡閉鎖的主要原因，而卵泡的加速閉鎖可能引起女性生育力下降和卵巢早衰，從而導(dǎo)致不孕[5]。雖然卵泡閉鎖的分子機(jī)制仍不明確，但研究發(fā)現(xiàn)一些miRNAs能通過其靶基因和不同的信號通路調(diào)控卵泡閉鎖。去乙酰化酶1(sirtuin-1，SIRT1)是小鼠卵巢顆粒細(xì)胞miR-22的靶向基因，miR-22通過抑制SIRT1表達(dá)來調(diào)控顆粒細(xì)胞凋亡，從而起到調(diào)節(jié)卵泡發(fā)育的作用[6]。Let-7g是let-7miRNA家族重要成員之一，轉(zhuǎn)化生長因子β受體1(transforming growth factor-β receptor 1，TGFBR1)是豬卵巢顆粒細(xì)胞中l(wèi)et-7g新的靶向基因，是TGF-β/SMAD信號通路的重要分子，該信號通路在哺乳動物顆粒細(xì)胞增殖和凋亡中發(fā)揮作用。Let-7g的過表達(dá)能誘發(fā)體外顆粒細(xì)胞凋亡，抑制TGFBR1 mRNA和蛋白質(zhì)水平以及SMAD3的磷酸化水平，說明let-7g作為表觀遺傳調(diào)節(jié)因子通過與TGF-β/SMAD信號通路的雙向負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用參與卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡及卵泡閉鎖[7]。在人卵巢顆粒細(xì)胞中，miR-23a和miR-27a通過FasL-Fas途徑直接靶向SMAD5基因從而促進(jìn)顆粒細(xì)胞的凋亡[8]。

1.2 miRNAs對排卵的影響

miR-200b和miR-429作為miR-200家族成員，能顯著影響雌性小鼠生殖功能。miR-200b和miRNA-429特異性敲除的小鼠表現(xiàn)下丘腦-垂體-卵巢軸缺陷，無法排卵。這兩個miRNAs的敲除使鋅指E盒結(jié)合同源盒蛋白1(Zinc finger E-box-binding homeobox 1，ZEB1)mRNA表達(dá)增加。ZEB1蛋白是促黃體生成素(luteinizing hormone，LH)基因的核抑制因子，能夠抑制LH的轉(zhuǎn)錄，取消LH峰，從而導(dǎo)致無排卵[9]。后期發(fā)現(xiàn)miR-200b和miR-429在人的排卵過程中也發(fā)揮作用。無排卵的多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)患者血清中miR-200b和miR-429的表達(dá)明顯高于自發(fā)排卵的女性。這些結(jié)果雖然不能確定miRNAs表達(dá)改變是導(dǎo)致無排卵的原因，但提示miRNAs可能作為排卵過程的生物標(biāo)記物，維持正常的排卵功能[10]。

1.3 miRNAs對黃體的影響

黃體是臨時的內(nèi)分泌腺，通過分泌孕酮維持正常妊娠。黃體功能不全導(dǎo)致女性不孕，而黃體功能不全的重要因素就是孕酮分泌下降。Drosha是miRNA合成所特有的重要酶，Maalouf等[11]研究發(fā)現(xiàn)Drosha敲除的黃體細(xì)胞孕酮合成下降，黃體細(xì)胞凋亡增多。認(rèn)為孕酮的降低可能是由于miRNA直接作用于類固醇合成途徑，或是由于凋亡導(dǎo)致細(xì)胞減少所致。從黃體形成到黃體功能達(dá)到高峰的這一過程中，miRNAs的表達(dá)發(fā)生改變，說明其可能參與黃體的形成。Maalouf等[12]首次研究了妊娠期母體識別階段miRNAs對黃體功能的調(diào)節(jié)作用，發(fā)現(xiàn)周期黃體和妊娠黃體中的一些miRNAs表達(dá)發(fā)生改變。靶向分析這些miRNAs對應(yīng)的靶向基因，集中于類固醇激素合成、凋亡和免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)路徑，說明在妊娠母體識別過程中，miRNAs表達(dá)變化對調(diào)節(jié)黃體功能和黃體存活有重要作用。

2 miRNAs和卵巢功能紊亂

2.1 miRNAs與PCOS

PCOS是育齡期女性最常見的內(nèi)分泌代謝疾病之一。研究認(rèn)為PCOS是由于類固醇激素合成的調(diào)節(jié)異常，特別是卵巢雄激素分泌異常所致。顆粒細(xì)胞中miRNAs可能對參與卵泡發(fā)育和卵巢類固醇合成的特定基因有直接的調(diào)控作用。Sang等[13]和Roth等[14]分別鑒定了PCOS患者卵泡液上清中的miRNAs，其發(fā)現(xiàn)PCOS組與對照組相比miRNAs表達(dá)存在差異。前者研究了與類固醇合成有關(guān)的7個miRNAs(miR-132、miR-320、miR-24、miR-520c-3p、miR-193b、miR-483-5p和miR-222)，其中miR-132、miR-320、miR-520c-3p和miR-222調(diào)節(jié)雌二醇的濃度，miR-24、miR-193b和miR-483-5p調(diào)節(jié)孕酮的濃度。在PCOS組中miR-132和miR-320表達(dá)均顯著下降。雖然目前這些miRNAs調(diào)節(jié)孕酮和雌二醇表達(dá)以及黃體分泌的機(jī)制還不清楚，但通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)表達(dá)最高的miRNAs靶基因與生殖、內(nèi)分泌和代謝過程均有關(guān)。后者的研究發(fā)現(xiàn)5個miRNAs(hsa-miR-9、hsa-miR-18b、hsa-miR-32、hsa-miR-34c和hsa-miR-135a)在PCOS組明顯過表達(dá)。PCOS組中3個miRNAs靶基因表達(dá)顯著下降，包括胰島素受體底物-2、突觸-1和白細(xì)胞介素-8。這3個靶基因的功能都與PCOS表型有關(guān)，包括碳水化合物代謝作用、β細(xì)胞功能、細(xì)胞與細(xì)胞間的連接以及類固醇合成。此外，PCOS患者卵丘細(xì)胞中miR-483-5p和miR-486-5p表達(dá)下降，其靶基因細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子3(suppressor of cytokine signaling 3，SOCS3)、血清反應(yīng)因子(serum response factor，SRF)、第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10，PTEN)和叉頭框蛋白O1(forkhead box protein O1，F(xiàn)OXO1)明顯增加，miR-483-5p的宿主基因胰島素樣生長因子顯著下降，表明miR-483-5p可能對降低胰島素抵抗發(fā)揮重要作用，通過激活PI3K/Akt促進(jìn)卵丘細(xì)胞增殖[15]。這些miRNAs及其靶向基因在卵丘細(xì)胞中的差異表達(dá)可能解釋了PCOS女性卵泡發(fā)育異常和不孕的原因。

2.2 miRNAs與卵巢早衰

卵巢早衰指40歲前卵巢功能缺失，導(dǎo)致閉經(jīng)、雌激素過少、促性腺激素升高，是引起不孕的主要因素。有研究認(rèn)為，卵巢早衰可能是由于卵巢發(fā)育過程中形成的卵泡數(shù)降低或是卵泡丟失率增加導(dǎo)致。卵巢顆粒細(xì)胞凋亡被認(rèn)為是卵巢早衰的重要因素，了解其調(diào)控機(jī)制對卵巢早衰的治療十分重要。miRNA微陣列分析發(fā)現(xiàn)卵巢早衰患者血漿中的miRNAs表達(dá)發(fā)生改變，其中10個miRNAs( miR-202、miR-146a、miR-125b-2、miR-139-3p、miR-654-5p、miR-27a、miR-765、miR-23a、miR-342-3p和miR-126)在卵巢早衰患者中的表達(dá)升高，2個miRNAs(let-7c和miR-144)表達(dá)降低[16]。在人卵巢顆粒細(xì)胞中，miR-146a通過與靶向基因白介素-1受體相關(guān)激酶-1( interleukin-1 receptor associated kinases-1，IRAK-1)和腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(tumor necrosis factor receptor-associated factor 6，TRAF6)的作用來調(diào)節(jié)顆粒細(xì)胞凋亡，其上調(diào)誘發(fā)顆粒細(xì)胞凋亡，其下調(diào)則減少顆粒細(xì)胞凋亡[17]。通過研究大鼠卵巢早衰模型miRNAs表達(dá)變化揭示了miRNAs在卵巢早衰發(fā)生中的分子作用，其中63個miRNAs的表達(dá)被上調(diào)，20個miRNAs被下調(diào)[18]。這些miRNAs的研究結(jié)果為臨床治療卵巢早衰等疑難性不孕疾病提供了新的治療方向，不同物種中miRNAs在卵巢功能中的作用見表1。

表1不同物種中miRNAs在卵巢功能中的作用

Table 1 Function of miRNAs on ovary in different species

表達(dá)部位物種作用顆粒細(xì)胞小鼠激素合成、顆粒細(xì)胞增殖[4]顆粒細(xì)胞小鼠顆粒細(xì)胞凋亡[6]顆粒細(xì)胞豬顆粒細(xì)胞凋亡[7]顆粒細(xì)胞人顆粒細(xì)胞凋亡[8]垂體、血清小鼠、人排卵[9-10]黃體細(xì)胞牛黃體細(xì)胞凋亡[11-12]卵泡液人類固醇合成[13-14]卵丘細(xì)胞人卵泡發(fā)育[15]血漿人顆粒細(xì)胞凋亡[16]顆粒細(xì)胞人顆粒細(xì)胞凋亡[17]卵巢大鼠顆粒細(xì)胞凋亡[18]

3 miRNAs對子宮內(nèi)膜容受性的影響

胚胎成功著床依賴于胚胎質(zhì)量、胚胎與子宮內(nèi)膜的相互作用以及子宮內(nèi)膜的容受性，幾乎多數(shù)著床失敗是由于子宮內(nèi)膜容受性差所致。子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞蛻膜化受損容易發(fā)生延遲著床，引起早期妊娠失敗。因此，基于子宮內(nèi)膜在著床中的重要作用，進(jìn)一步了解子宮內(nèi)膜容受性及其作用機(jī)制十分重要。到目前為止，還未出現(xiàn)有效的診斷工具用于準(zhǔn)確預(yù)測子宮內(nèi)膜容受性[19]。研究發(fā)現(xiàn)一些特定的miRNAs與子宮內(nèi)膜容受性和子宮蛻膜反應(yīng)有關(guān)。利用miRNA芯片對子宮內(nèi)膜容受性進(jìn)行的研究通常分為兩類：一是比較育齡期女性增殖期到著床期子宮內(nèi)膜基因組的動態(tài)表達(dá)；二是研究生育和不孕女性基因組的表達(dá)變化。Kresowik等[20]篩選育齡女性正常月經(jīng)周期增殖期和分泌期子宮內(nèi)膜組織和血清中miRNAs的表達(dá)。發(fā)現(xiàn)一些miRNAs在子宮內(nèi)膜組織分泌期的表達(dá)顯著增加，其中miR-31還存在于血清中，認(rèn)為miR-31可能通過免疫抑制機(jī)制作為子宮內(nèi)膜容受性最佳的生物標(biāo)志物。在小鼠及人的內(nèi)膜組織中，容受期前和容受期的miRNAs表達(dá)發(fā)生改變[21]。miRNA家族包括let-7、miR-30、miR-200、miR-17-92以及miR-494和miR-923均被推測能夠調(diào)節(jié)并促進(jìn)子宮內(nèi)膜容受性相關(guān)基因的表達(dá)[21-22]。研究證實，圍著床期子宮內(nèi)膜-胚胎之間的相互作用受miRNAs的調(diào)節(jié)，這些miRNAs存在于子宮內(nèi)膜或胚胎分泌的多泡體中，提示miRNAs可能在胚胎著床過程中發(fā)揮作用[23]。

4研究展望

miRNAs在體液和組織中豐富而穩(wěn)定，作為微創(chuàng)診斷生物標(biāo)記物具有更廣闊的前景，比當(dāng)下的診斷標(biāo)記物更敏感更特異。由于miRNAs具有高度的保守性，能很大程度上保持臨床樣本的完整性，調(diào)控生殖疾病的分子表型，評估和監(jiān)測機(jī)體的病理生理狀態(tài)，已經(jīng)逐漸作為新的生物標(biāo)記物應(yīng)用于轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)的臨床診斷中。自首次報道m(xù)iRNAs可以作為癌癥的生物標(biāo)記物以來，大量研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)血清/血漿miRNAs的表達(dá)隨著生理或病理條件的改變發(fā)生顯著變化。通過血清miRNAs高通量檢測篩選出表達(dá)差異顯著的miRNAs，可作為標(biāo)記物用以區(qū)分PCOS患者和對照組[24]。雖然血清miRNAs可作為評估卵巢功能的生物標(biāo)記物，但PCOS卵巢組織上表達(dá)差異的大多數(shù)miRNAs并不能釋放到血液中，從而無法在血清中檢測到[25]。在未來研究中，還要進(jìn)一步探討miRNAs作為女性生殖體統(tǒng)的潛在生物標(biāo)記物的作用，為確定卵巢儲備能力，卵巢內(nèi)分泌功能，評估促排卵藥物的有效性以及胚胎著床的過程提供更多生物信息。此外，miRNAs有望提升生殖系統(tǒng)疾病早期診斷的價值，加速個性化治療的應(yīng)用前景，從而解決生殖醫(yī)學(xué)中不斷增多的生育問題。