鋅指蛋白2在卵巢畸胎瘤中的表達及其臨床意義

周廣銀

(山東省臨沂市蘭山區人民醫院，山東 臨沂 276002)

卵巢畸胎瘤是常見的卵巢生殖細胞腫瘤，占全部卵巢腫瘤的20%左右，占生殖細胞腫瘤的80%以上，多發生于育齡期婦女[1]。根據其成熟程度可分為成熟性、交界性及未成熟卵巢畸胎瘤，其中交界性及未成熟卵巢畸胎瘤具有惡性傾向，對患者的生命健康造成極大危害。鋅指蛋白2(Zinc finger protein2，Snail2)近年被發現參與多種惡性腫瘤的發生發展，如子宮內膜癌、乳腺癌等[2]。基于此，本研究擬通過檢測Snail2在不同分化程度的卵巢畸胎瘤中的表達，并分析與患者臨床資料間的相關性，從而明確Snail2與卵巢畸胎瘤的關系，以期為揭示卵巢畸胎瘤惡變機制及臨床診治工作提供新的線索。

1材料與方法

1.1臨床資料

臨床選取山東省臨沂市蘭山區人民醫院2011年5月至2016年9月收治的98例初發初治的卵巢畸胎瘤患者，病例均經過術中或術后病理檢查確診，且不合并其他器質性疾病及惡性腫瘤。其中成熟卵巢畸胎瘤患者76例，患者年齡19～41歲，平均(27.3±9.2)歲，體重45.5～82.7kg，平均(58.2±10.3kg)；身體質量指數(body mass index，BMI)16.3～32.6kg/m2，平均(21.7±4.4)kg/m2。交界性卵巢畸胎瘤患者13例；患者年齡22～43歲，平均(28.5±11.1)歲，體重51.3～77.6kg，平均(61.2±11.9)kg；BMI 16.8～33.1kg/m2，平均(23.0±6.3)kg/m2。未成熟畸胎瘤患者9例；患者年齡22～37歲，平均(28.3±12.8)歲；體重47.8～75.2kg，平均(60.3±14.1)kg；BMI 15.7～31.4 kg/m2，平均(20.4±6.8)kg/m2。三組患者年齡、體重及BMI指數之間均無顯著差異(均P>0.05)，具有可比性。未成熟畸胎瘤患者的TNM分期以2013年國際婦產科聯盟(The International Federation of Gynecology and Obst￣etrics，FIGO)發布的《FIGO 2013卵巢癌、輸卵管癌、腹膜癌分期》為標準[3]，Ⅰ期3例(33.33%)，Ⅱ期2例(22.22%)，Ⅲ期4例(44.44%)。

1.2實驗材料

主要實驗儀器包括：Applied Biosystems 7500 Real-time PCR儀，Bio-Rad S1000 PCR 基因擴增儀，NanoDrop2000超微量分光光度計，Eppendorf 5424r離心機，Eppendorf移液器及對應的Axygen Brand Products加樣吸頭，Axygen Brand Products 1.5mL離心管等。主要實驗試劑包括：國藥集團化學試劑有限公司的氯仿、無水乙醇、異丙醇，Thermo Fisher Scientific公司的TRIzol，Fermentas的逆轉錄試劑盒以及Bio-Rad SYBR Green定量PCR試劑盒。

1.3實驗方法

手術取出腫瘤后組織送至病檢，留20mg組織-80℃保存，抽提RNA時在組織中加入1mL TRIzol，并在冰上裂解，裂解過程中眼科剪盡量剪碎組織，5分鐘后12 000g 4℃離心5分鐘，收集上清液至準備好的新離心管中，加入200μL氯仿，震蕩混勻后靜置5分鐘，12 000g 4℃離心15分鐘，收集上清液至準備好的新離心管中，加入1mL異丙醇，室溫靜置10分鐘，去上清后75%乙醇清洗沉淀，7 500 g 4℃離心5分鐘，盡量吸去上清，室溫下風干后20μL ddH2O稀釋。超微量分光光度計檢測RNA濃度，取1μg行逆轉錄，所有反應在冰上進行操作，將混合好的反應液1以3μL/孔加入八連管中，加無核酶水至10μL；42℃，配置反應液2，無核酶水定容至20μL；37℃，15分鐘后85℃ 5秒，得到的cDNA稀釋至500μL。Cyber Green熒光實時定量PCR反應體系檢測基因表達水平。反應條件：預變性 94℃4min，擴增條件 94℃ 30秒，60℃ 1 分鐘，40個循環。引物情況見表1，內參基因β-actin產物長度286bp，Snail2產物長度249bp。

表1熒光定量引物

Table 1 Fluorescent quantitative primers

Name of primerSequence (5'-3')Snail2(F)GACGCAATCAATGTTTACTCSnail2(R)TAAAGATAATCCTTTCCATGβ-actin(F)CTCCATCCTGGCCTCGCTGTβ-actin(R)GCTGTCACCTTCACCGTTCC

1.4統計學方法

2結果

2.1卵巢畸胎瘤組織中Snail2 mRNA的表達

成熟卵巢畸胎瘤組織相對表達量為0.072±0.027，顯著低于交界性瘤0.132±0.049和未成熟卵巢畸胎瘤組織0.171±0.036，差異有統計學意義(F=16.380，Q值分別為5.408、8.335，P<0.05)，交界性與未成熟卵巢畸胎瘤組織Snail2表達無顯著性差異(Q=2.261，P>0.05)，見圖1。

圖1患者臨床樣本中Snail2 mRNA的表達水平

Fig.1 The expression levels of Snail2 mRNA in clinical samples of patients

2.2卵巢畸胎瘤組織中Snail2的表達與患者年齡、體重、BMI及腫瘤大小的相關性

相關性分析結果顯示Snail2 mRNA的表達水平與患者年齡、體重及BMI的相關性無統計學意義(均P>0.05)，與患者腫瘤大小有顯著正相關性(P<0.001)，見表2。

2.3卵巢畸胎瘤組織中Snail2的表達與患者TNM分期的相關性

相關性分析結果顯示Snail2 mRNA的表達水平與患者TNM分期存在顯著正相關性(rs=0.589，P<0.05)。

表2卵巢畸胎瘤組織Snail2表達水平與患者一般資料的相關性

Table 2 The correlation between the expression levels of Snail2 in ovarian teratoma and general data of patients

Snail2表達水平年齡體重BMI腫瘤大小rs0.106-0.173-0.2480.625P0.3670.2400.136<0.001

3討論

3.1 Snail2在惡性腫瘤中的表達及其生物學意義

Snail2基因位于染色體8q11.21上，其編碼的鋅指轉錄蛋白Snail2廣泛分布于體內各組織，在正常機體內參與神經嵴細胞的產生和遷移[4]。近年許多研究指出，Snail2參與多種腫瘤的惡變及進展過程：①Snail2在惡性程度較高的基底細胞樣型乳腺癌中高表達，可促進乳腺癌細胞上皮間充質轉化(epithelial mesenchymal transition，EMT)進程，并促進乳腺癌細胞干性的維持，加深細胞的惡性程度[5]；②Snail2同樣可促進肺癌細胞EMT進程及干性轉化，并可促腫瘤細胞的增殖轉移能力[6]；③Snail2可促進胃癌細胞EMT進程，并促進胃癌細胞的增殖轉移能力；④Snail2可促進結直腸癌細胞HCT116的增殖侵襲能力，并誘導細胞放療抵抗的形成[7]；⑤Snail2還可抑制前列腺癌細胞中抑癌基因PTEN的表達，促進細胞增殖及侵襲，并可通過激活CXCR4/CXCL12信號通路維持前列腺癌細胞的干細胞特性[8]；⑥Snail2也被發現在宮頸癌中高表達，且促進宮頸癌細胞EMT進程[9]。

3.2 Snail2在惡性腫瘤中的臨床意義

Snail2在臨床水平也被發現與多種惡性腫瘤的發生發展密切相關：①Snail2與乳腺癌患者TNM分期及不良預后呈正相關[5]；②非小細胞肺癌患者腫瘤組織高表達Snail2提示患者預后不良[6]；③Snail2的高表達與結直腸癌患者淋巴結轉移及不良預后也呈現出顯著正相關[10]；④Snail2還可促進前列腺癌去勢抵抗的形成，導致患者預后不良[11]；⑤同樣在宮頸癌中發現Snail2的表達與患者腫瘤組織的分化程度、淋巴結轉移情況、浸潤深度、FIGO分期及預后均顯著相關[9]，以上結果均提示Snail2的對惡性腫瘤進展的促進作用。

3.3 Snail2在卵巢畸胎瘤中的表達及其臨床意義

本研究檢測了不同惡性程度卵巢畸胎瘤中Snail2的表達情況，結果顯示，分化較好的成熟卵巢畸胎瘤組織Snail2的表達顯著低于分化較差的交界性及未成熟卵巢畸胎瘤(P<0.05)，提示Snail2對于卵巢畸胎瘤惡性轉變過程中可能發揮重要作用，但交界性卵巢畸胎瘤與未成熟卵巢畸胎瘤Snail2的表達差異無統計學意義(P>0.05)，推測可能是由于樣本量不足所致。相關性分析結果顯示Snail2與患者腫瘤大小及未成熟卵巢畸胎瘤TNM分期呈顯著的正相關性(P<0.05)，提示Snail2對卵巢畸胎瘤的增殖及惡性進展存在明顯的促進作用。結合Kaplan-meier Plotter數據庫(http://kmplot.com/analysis/index.php?p=service&cancer=ovar)資料顯示的1 306例卵巢癌患者的生存率與Snail2表達水平的相關性，結果顯示高表達組卵巢癌患者的生存時間明顯少于低表達組(P=0.039)，提示Snail2高表達患者預后不良，見圖2。

圖2卵巢癌患者的生存率與Snail2表達水平的相關性

Fig. 2 Correlation between the survival rate of ovarian cancer and the expression level of Snail2

綜上所述，可以認為Snail2在卵巢畸胎瘤中發揮促癌作用。在進一步的研究中將繼續擴大臨床樣本量，并通過體內體外實驗對Snail2與卵巢畸胎瘤的關系進行驗證，探究其對細胞惡性轉化、增殖、轉移及EMT進程的影響，并探索其可能的相互作用分子，揭示Snail2引起卵巢畸胎瘤惡變的確切機制，為臨床診治工作的奠定基礎。